In This Article

Summary

Здесь мы представляем протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo , что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.

Abstract

Эпилепсия – это неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивирующими припадками, частично коррелированными с генетическим происхождением, которым страдают более 70 миллионов человек во всем мире. Несмотря на клиническое значение эпилепсии, функциональный анализ нервной активности в центральной нервной системе еще предстоит разработать. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании со стабильной экспрессией генетически кодируемых индикаторов кальция, таких как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне отдельных клеток. Drosophila melanogaster появилась как инструмент для исследования молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе эпилепсии, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим анализам. В этом исследовании мы представляем новый и эффективный протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Весь мозг подготавливается из cac, хорошо известного гена эпилепсии, для визуализации кальция с помощью конфокального микроскопа, чтобы идентифицировать нейронную активность в качестве последующего анализа на судорожное поведение. Мухи-нокдауны CAC показали более высокую частоту судорожного поведения и аномальную активность кальция, включая более крупные шипы и меньшее количество мелких шипов, чем мухи дикого типа. Активность кальция коррелировала с судорожным поведением. Эта методология служит эффективной методологией скрининга патогенных генов эпилепсии и изучения потенциального механизма эпилепсии на клеточном уровне.

Introduction

Эпилепсия, сложное хроническое неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивами спонтанных и неспровоцированных припадков и аберрантной активностью нейронной сети, затронула более 70 миллионов человек во всем мире, что делает ее одним из наиболее распространенных неврологическихзаболеваний1 и приводит к тяжелому бремени для семей и общества. Принимая во внимание влияние эпилепсии, было проведено множество исследований для определения этиологии припадков, из которых генетика была признана основной причиной многих типов эпилепсии или эпилептическихсиндромов. За последние десятилетия достижения в области геномных технологий привели к быстрому увеличению числа открытий новых генов, связанных с эпилепсией, которые играют решающую роль в возникновении судорог, включая гены ионных каналов и неионных каналов 3,4. Тем не менее, основные механизмы и функциональный анализ между генами и эпилептическими фенотипами до конца не изучены. Идентификация генов и механизмов, связанных с эпилепсией, дает возможность эффективно вести пациентов 5,6.

Цитозольные кальциевые сигналы являются ключевыми элементами нейрональной активности и синаптической передачи. Визуализация кальция, включая срезы мозга7, in vivo 8,9 и ex vivo10, используется для мониторинга активности нейронов11 в качестве маркера возбудимости нейроновс 1970-х годов 12,13. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании с генетически кодируемыми кальциевыми индикаторами (GECI), такими как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне разрешения одной клетки14, 15, 16, что имеет высокий уровень пространственно-временной точности. Изменения концентрации кальция и переходных процессов наблюдались в потенциалах действия и синаптической передаче соответственно14, что указывает на то, что изменение внутриклеточных уровней кальция проявляет строгую корреляцию с электрической возбудимостью нейронов17,18. Визуализация кальция также применялась в качестве модели судорогразвития 9 и выполнялась у дрозофилы для скрининга противосудорожных соединений19.

Drosophila melanogaster становится мощным модельным организмом в научных исследованиях, таких как эпилепсия, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим тестам 20,21,22. Более того, усовершенствованные генетические инструменты дрозофилы способствовали экспрессии генетически кодируемого кальциевого индикатора GCaMP6. Например, бинарные транскрипционные системы на основе Gal4 и UAS обеспечивают специфическую экспрессию GCaMP6 пространственно и во времени. Поскольку дрозофила является крошечным организмом, визуализация кальция in vivo требует профессиональных операционных навыков для выполнения хирургического вмешательства, при котором только небольшая часть спинного мозга обнажалась через маленькое окно14,23. В то же время, визуализация кальция ex vivo в интактном мозге дрозофилы может быть использована для мониторинга областей интереса (ROI) всего мозга.

В этом исследовании мы представляем визуализацию ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. CACNA1A является хорошо известным геном эпилепсии, CAC относится к каналу Cav2, который является гомологом CACNA1A. Мы начали с препарирования мозга мух-нокдаунов САС tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi и визуализации их с помощью конфокального микроскопа с режимом рентгеновского сканирования. Затем мы проанализировали изменения кальциевых сигналов ROI, рассчитав показатели, которые количественно оценивают спонтанные судорожные события, такие как значение %ΔF/F и кальциевые события флуоресценции GCaMP6. Кроме того, мы проводили механический стимул с помощью вихревой машины, чтобы индуцировать тесты на судорожное поведение мух, нокдаунов CAC, а также валидировать результаты визуализации кальция. В целом, этот протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo, что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Протокол для анализа, чувствительного к взрыву

  1. Установить экспериментальные мухи путем скрещивания линии драйвера tub-Gal4 с линией UAS-cac-RNAi через систему21 Gal4/UAS. Соберите девственных мух линии tub-Gal4 и самцов мух линии UAS-cac-RNAi . Затем переложите девственницу и самцов мух в один флакон, чтобы собрать потомство.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линия драйверов tub-Gal4 позволит добиться глобального нокдауна гена cac . В качестве контрольной группы используйте линию UAS-cac-RNAi .
  2. Через 3-5 дней после эклозии осторожно обезболивайте мух с помощью 100%CO2 (анестезиологическое оборудование CO2 ) и соберите щеткой мухи tub-Gal4>UAS-cac-RNAi и мухи UAS-cac-RNAi . Пересадите этих мух в новые, чистые флаконы с кормом за 1 день до тестирования, чтобы убедиться, что они хорошо приготовлены.
  3. Осторожно обезболивайте мух с помощью CO2. После обезболивания осторожно поместите 4-6 мух в отдельные свежие флаконы. Дайте мухам оправиться от анестезии в течение примерно 1 часа, прежде чем приступать к тестированию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого генотипа было протестировано не менее пяти испытаний, и каждое испытание состояло из шести флаконов мух.
  4. Настройте записывающее оборудование. Установите камеру (720–1080P, не менее 30–60 кадров в секунду, автофокусировка заблокирована) на штатив перед доской. Отрегулируйте фокусировку камеры вручную с помощью пустого флакона, чтобы обеспечить четкие и точные кадры.
  5. Используйте вихревой смеситель для выполнения механически индуцированного судорожного поведения. Поместите каждый флакон с 4-6 мухами в вихревой смеситель и запустите его на максимальной настройке (2800 об/мин) ровно на 10 секунд. После вихря быстро поместите флакон на доску.
  6. Понаблюдайте за мухами и запишите любое поведение, похожее на припадок, которое они проявляют.
    Примечание: Судорожное поведение, наблюдаемое у мух, состоит из трех стадий: судороги (проявляющиеся в виде вибрирующих крыльев), паралич и восстановление24. Отношение судорожных мух к испытуемым мухам определялось как частота судорог.
    1. Измерьте время восстановления как время, необходимое после вихря до тех пор, пока мухи не восстановят способность стоять вертикально25.

2. Протокол кальциевой визуализации головного мозга ex vivo

  1. Устанавливают мухи линейки tub-Gal4>UAS-GCaMP6m и tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi соответственно. Генерация мух с помощью системы двоичной экспрессии Gal4/UAS21 для мониторинга активности кальция в мозге ex vivo .
  2. Приготовьте раствор для вскрытия, как описано в прилагаемом рецепте (Таблица 1)26.
    1. Приготовьте наружный раствор, как описано в таблице 1. Доведите до pH 7,2 с NaOH и отрегулируйте осмолярность до 250-255 мОсм/л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наружный раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 недели.
    2. Для приготовления диссекционного раствора к 600 мкл наружного раствора добавляют 9 ЕД суспензии папаина и L-лизина (2 мг/мл). Встряхните раствор и подождите 15 минут, пока раствор не станет прозрачным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать раствор для вскрытия в течение 4 ч.
  3. Перед применением раствор для наружного применения обработать оксигенированным физиологическим раствором (95% кислорода и 5% углекислого газа) в течение 5 мин. С помощью пипетки перелейте около 10 мкл раствора для препарирования в чашку Петри. Это решение обеспечит необходимые условия для вскрытия и визуализации мозга.
  4. Тщательно препарируйте мозг обеих линий tub-Gal4>UAS-GCaMP6m и tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi с помощью игл шприца и микроскопа. Следуйте установленному протоколу вскрытия головного мозга27.
  5. С помощью пипетки переложите подготовленный мозг в записывающую чашку, содержащую 5 мл свежего наружного раствора, и иммобилизуйте мозг с помощью держателя до-диез в чашке для записи на 3-5 мин для восстановления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель до-диез изготовлен из металлического полукруга диаметром 7 мм, пересеченного параллельными волокнами на расстоянии 0,5 мм друг от друга.
  6. Настройка и получение конфокальной визуализации
    1. Для конфокальной визуализации захватите каждый мозг с помощью 20-кратного объектива и режима xyt-сканирования. Идентификация нейронов тела гриба с помощью дополнительного 4,5-кратного цифрового усиления на основе 20-кратного оптического усиления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый мозг ex vivo может быть визуализирован в течение более 1 часа.
    2. Получение полного излучения мозга-GCaMP6m при возбуждении лазера с длиной волны 488 нм и мощностью лазера 16 мкВт. Установите параметры сканирования на скорость 400 пикселей с размером пикселя 256 x 256 пикселей. Используйте частоту сбора данных 5,3 Гц и записывайте в течение 3 минут.
  7. Определите 5-8 ROI в каждом мозге и проанализируйте флуоресценцию. Вручную определите тело клетки нейронов тела гриба в качестве интересующей области28.
    1. Пометьте идентифицированные нейроны и измерьте интенсивность их флуоресценции с помощью ImageJ. Проанализируйте данные флуоресценции GCaMP6m с помощью %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Внутриклеточную флуоресценцию, увеличивающуюся на 2-2,5 стандартных отклонения выше исходного уровня, определяют как небольшие пики, а внутриклеточную флуоресценцию, увеличивающуюся более чем на 2,5 стандартных отклонения над исходным уровнем, как большие спайки. Проанализируйте частоту скачков кальция с помощью t-критерия Стьюдента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: F0 была определена как базовая линия по средней интенсивности флуоресценции начальных 5 кадров в ROI, F1 как интенсивность флуоресценции в данный момент времени, а B как фон без флуоресценции. Временная физиологическая активность нейронов также помогает отличить их от шумовых знаков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Используя этот протокол, мы обнаружили, что мухи с нокдауном cac показали значительно более высокие показатели судорожного поведения, чем мухи WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] против 4,50 ± 2,03 [n = 6]; Р = 0,0061; t-критерий Стьюдента, рисунок 1А). Большинство мух tub-Gal4>UAS-cac-RNAi вы...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ион кальция служит важным вторым мессенджером, играя ключевую роль в ряде физиологических и патофизиологических реакций как на химические, так и на электрические возмущения. Кроме того, топологический элемент пресинаптических P/Q-каналов, кодируемый геном CACNA1A человека, был иденти...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Гуандунским фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (грант No 2022A1515111123 Jing-Da Qiao) и планом по расширению научных исследований в GMU (Jing-Da Qiao). Эта работа также была поддержана Планом развития инновационных способностей студентов Медицинского университета Гуанчжоу (No финансирования 02-408-2304-02038XM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BrushesPaneraAAhc022-2for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC4901
Confocal microscopeSP8; Zeiss, Jena, Germany.N/Afor calcium imaging
CO2 anesthesia machineN/AN/Afor Anesthetizing the flies.
C-sharp holderN/AN/Ahandmade, for mounting the brain
Culture vialsBiologix51-05002.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji softwareNational Institutes of Health, Bethesda, MD, USAversion: 2.14.0for analysis
Fly morgueN/AN/Ahandmade, for handling flies
Fly stockscac-RNAi27244from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocksGCaMP6m42750from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stockstub-Gal4N/Afrom the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
GlucoseSigma-AldrichG8270
High-resolution cameraN/AN/Afor recording the seizure-like behavior assay
L-lysineSigma-AldrichL5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)Sigma-AldrichM1028
Papain suspensionWorthington BiochemicalLS003126
Petri dishesSigma-AldrichSLW1480/02Dfor dissection
PipetteThermo Scientific4640010, 4640030, 4640050, 4640060for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP4504
Recording dishThermo Scientific150682- Glass Based Dishfor holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ScientificS25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-AldrichS8282
Stereo-binocular microscopeSHANG GUANGXTZ-Dfor handling flies and dissection
Syringe needlespythonbioHCL0693for dissection
TripodWEIFENG45634732523for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixerLab dancer, IKA, Germany/Sigma-AldrichZ653438for performing the seizure-like behavior assay
WhiteboardN/AN/Ahandmade, foam pad or paper for background

References

  1. Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
  2. Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
  3. Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
  4. Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
  5. Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780(2016).
  6. Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050(2021).
  7. Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
  8. Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
  9. Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701(2018).
  11. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  12. Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
  13. Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
  14. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  15. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  16. Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
  17. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  18. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
  19. Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461(2016).
  20. Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
  21. Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
  22. Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877(2023).
  23. Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
  24. Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
  25. Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
  26. Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467(2018).
  27. Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248(2007).
  28. Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
  29. Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
  30. Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
  31. Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
  32. Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461(2021).
  33. Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662(2022).
  34. Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994(2021).
  35. Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784(2016).
  36. Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769(2020).
  37. Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
  38. Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ex vivoGCaMP6