Ex vivo Кальциевая визуализация для модели эпилепсии дрозофилы

Резюме

Здесь мы представляем протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo , что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.

Аннотация

Эпилепсия – это неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивирующими припадками, частично коррелированными с генетическим происхождением, которым страдают более 70 миллионов человек во всем мире. Несмотря на клиническое значение эпилепсии, функциональный анализ нервной активности в центральной нервной системе еще предстоит разработать. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании со стабильной экспрессией генетически кодируемых индикаторов кальция, таких как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне отдельных клеток. Drosophila melanogaster появилась как инструмент для исследования молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе эпилепсии, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим анализам. В этом исследовании мы представляем новый и эффективный протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Весь мозг подготавливается из cac, хорошо известного гена эпилепсии, для визуализации кальция с помощью конфокального микроскопа, чтобы идентифицировать нейронную активность в качестве последующего анализа на судорожное поведение. Мухи-нокдауны CAC показали более высокую частоту судорожного поведения и аномальную активность кальция, включая более крупные шипы и меньшее количество мелких шипов, чем мухи дикого типа. Активность кальция коррелировала с судорожным поведением. Эта методология служит эффективной методологией скрининга патогенных генов эпилепсии и изучения потенциального механизма эпилепсии на клеточном уровне.

Введение

Эпилепсия, сложное хроническое неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивами спонтанных и неспровоцированных припадков и аберрантной активностью нейронной сети, затронула более 70 миллионов человек во всем мире, что делает ее одним из наиболее распространенных неврологических^{заболеваний1} и приводит к тяжелому бремени для семей и общества. Принимая во внимание влияние эпилепсии, было проведено множество исследований для определения этиологии припадков, из которых генетика была признана основной причиной многих типов эпилепсии или эпилептических^{синдромов.} За последние десятилетия достижения в области геномных ....

протокол

1. Протокол для анализа, чувствительного к взрыву

1. Установить экспериментальные мухи путем скрещивания линии драйвера tub-Gal4 с линией UAS-cac-RNAi через систему²¹ Gal4/UAS. Соберите девственных мух линии tub-Gal4 и самцов мух линии UAS-cac-RNAi . Затем переложите девственницу и самцов мух в один флакон, чтобы собрать потомство.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Линия драйверов tub-Gal4 позволит добиться глобального нокдауна гена cac . В качестве контрольной группы используйте линию UAS-cac-RNAi .
2. Через 3-5 дней после эклозии осторожно обезболивайте мух с помощью 1....

Результаты

Используя этот протокол, мы обнаружили, что мухи с нокдауном cac показали значительно более высокие показатели судорожного поведения, чем мухи WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] против 4,50 ± 2,03 [n = 6]; Р = 0,0061; t-критерий Стьюдента, рисунок 1А). Большинство мух tub-Gal4>UAS-cac-RNAi вы.......

Обсуждение

Ион кальция служит важным вторым мессенджером, играя ключевую роль в ряде физиологических и патофизиологических реакций как на химические, так и на электрические возмущения. Кроме того, топологический элемент пресинаптических P/Q-каналов, кодируемый геном CACNA1A человека, был иденти.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background