Микродиссекция и иммунофлуоресцентное окрашивание рукавов миокарда в легочных венах мышей

Резюме

Этот протокол демонстрирует изоляцию под контролем микроскопии и иммунофлуоресцентное окрашивание легочных вен мышей. Мы подготавливаем образцы тканей, содержащие левое предсердие, легочные вены и соответствующие легкие, и окрашиваем их на сердечные тропонины Т и коннексин 43.

Аннотация

Легочные вены (ЛВ) являются основным источником эктопических биений при предсердных аритмиях и играют решающую роль в развитии и прогрессировании фибрилляции предсердий (ФП). ПВ содержат рукава миокарда (МС), состоящие из кардиомиоцитов. Рассеянный склероз участвует в инициации и поддержании мерцательной аритмии, поскольку он сохраняет сходство с работающим миокардом сердца, включая способность генерировать эктопические электрические импульсы. Грызуны широко используются и могут представлять собой отличные животные модели для изучения миокарда легочной вены, поскольку кардиомиоциты широко представлены по всей стенке сосуда. Тем не менее, точное микровскрытие и приготовление мышиных ПВ является сложной задачей из-за небольшого размера органа и сложной анатомии.

Мы демонстрируем протокол микродиссекции под контролем микроскопии для изоляции левого предсердия мыши (ЛП) вместе с ЛВ. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием сердечных антител к тропонину-Т (цТНТ) и коннексину 43 (Сх43) выполняется для визуализации ЛП и ЛП в полный рост. Визуализация при 10-кратном и 40-кратном увеличении обеспечивает всестороннее представление о структуре ФВ, а также детальное представление об архитектуре миокарда, в частности, подчеркивая присутствие коннексина 43 в МС.

Введение

Фибрилляция предсердий (ФП) является наиболее распространенной устойчивой аритмией¹. Распространенность мерцательной аритмии продолжает расти: ожидается, что в 2060 г. число пациентов в Европе составит ~17,9 млн^1. Мерцательная аритмия имеет большое клиническое значение, поскольку является существенным фактором риска развития инфаркта миокарда, сердечной недостаточности или инсульта, что приводит к огромному индивидуальному, социальному и социально-экономическому бремени1^. Несмотря на то, что мерцательная аритмия известна уже несколько десятилетий, патофизиология мерцательной аритмии до сих пор до конца не изучена².

Уже в конце 1990-х годов исследования продемонстрировали большое влияние легочных вен (ЛП) на инициацию и поддержание мерцательной аритмии, поскольку они являются основным источником эктопических^{сокращений,} вызывающих мерцательную аритмию. Показано, что ВВ структурно отличаются от других кровеносных сосудов. В то время как типичные кровеносные сосуды содержат гладкомышечные клетки, оболочка ВП также содержит кардиомиоциты⁴. У грызунов эта сердечная мускулатура повсеместно присутствует на протяжении всего ВП, включая внутри- и внелегочные отделы, а также область отверстия⁵. У человека ВП также содержат кардиомиоциты, которые можно наблюдать в расширениях миокарда левого предсердия (ЛП) — так называемых рукавах миокарда (МС)^6,7.

Рассеянный склероз имеет морфологическое сходство с миокардом предсердий⁸. Форма и размер предсердий и кардиомиоцитов ВП существенно не различаются между собой и демонстрируют сопоставимые электрофизиологические свойства⁸. Электрофизиологические записи в ПВ доказали электрическую активность рассеянного склероза, а ангиографическая визуализация выявила сокращения, синхронизированные с сердцебиением ^9,10.

Щелевые контакты представляют собой порообразующие белковые комплексы, состоящие из шести субъединиц коннексина, которые обеспечивают прохождение ионов и малых молекул¹¹. Щелевые контакты существуют в межклеточных аппозициях, соединяют между собой соседние кардиомиоциты и обеспечивают межклеточное электрическое соединение между кардиомиоцитами^12,13. В сердце экспрессируется несколько изоформ коннексина, причем коннексин 43 (Cx43) является наиболее распространенной изоформой, экспрессируемой во всех областях сердца¹⁴. Предыдущие исследования свидетельствуют об экспрессии Cx43 в кардиомиоцитах PV^15,16.

По-прежнему сложно исследовать рассеянный склероз в интактных ФВ из-за их тонкой структуры, особенно на моделях мелких животных. В этой статье мы продемонстрируем, как идентифицировать и изолировать ВП вместе с ЛП и долями легких у мышей с помощью микродиссекции под контролем микроскопии. Кроме того, мы демонстрируем иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание ФВ для визуализации кардиомиоцитов и их взаимосвязей внутри ФВ.

протокол

Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета им. Людвига-Максимилиана, а все процедуры с использованием мышей были одобрены Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, РОБ 55.2-2532. Vet_02-18-46, РОБ 55.2-2532. Vet_02-19-86, РОБ 55.2-2532. Vet_02-21-178, РОБ 55.2-2532. Vet_02-22-170). Мыши C57BL6/N были получены в промышленных масштабах.

1. Подготовка

1. Приготовьте 3% агарозный гель, смешав 3 мг агарозы и 100 мл 1x Tris-буферного физиологического раствора в колбе Эрленмейера объемом 500 мл. Нагрейте раствор в микроволновой печи при мощности 600 Вт в течение 2-3 мин, пока гель не станет однородным.
2. Подготовьте чашку для препарирования, аккуратно перелив гель в чашку Петри диаметром 100 мм. Наполните чашку Петри гелем наполовину. Очистите гель от пузырьков, чтобы обеспечить однородную консистенцию. Дайте чашке для препарирования остыть, пока гель не затвердеет.
3. Приготовьте все необходимые буферы и растворы, включая фиксирующий раствор, раствор для пермеабилизации, блокирующий буфер и промывочный буфер в соответствии с рецептами, приведенными в таблице 1.

2. Забор органов и подготовка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Обширный протокол с подробным описанием процедуры мышиной анестезии и забора сердца был опубликован ранее^17,18. Таким образом, мы приводим лишь краткое описание этой части. Эксперименты проводились на мышах C57BL6 в возрасте от 12 до 16 недель (шесть самцов, четыре самки). Масса тела самца увеличилась с 26 г до 28 г, а самки — с 19 г до 22 г. Следующие этапы выполнялись без предварительной системной инъекции гепарина.

1. Обезболивайте мышь изофлураном (5%, 95% кислорода, расход: 1 л/мин) и обеспечьте достаточную глубину анестезии.
2. Переместите мышь на операционный стол, расположив ее в положении лежа на спине. Поддерживайте наркоз ингаляцией изофлурана (2%, 98% кислорода, расход: 1 л/мин) через наркозную маску и фиксируйте мышь скотчем на концах. Вводят фентанил для обезболивания (0,1 мг/25 г массы тела в/в).
3. Приподнимите мех на мечевидном отростке и установите поперечный срез 2 мм. Отделите шерсть от подкожной фасции с помощью тупого рассечения (тыльной стороной ножниц) и удлините разрез краниально и латерально, чтобы обнажить грудную клетку.
4. Осторожно вскрывают брюшко хвостом к реберной дуге. Слегка приподнимите мечевидный отросток, чтобы разрезать диафрагму от каудальной и вызвать коллапс легких. Затем разрежьте диафрагму слева направо, не повредив ни одного органа, и откройте грудную клетку с двух сторон, чтобы обнажить сердце.
5. Перережьте нижнюю полую вену (IVC), пока сердце все еще бьется, чтобы обескровить мышь, и приступайте к перфузии сердца, проникая в левый желудочек иглой 27 G и вводя 10 мл ледяного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
6. Очистив сердце мыши от крови, найдите дугу аорты, верхнюю полую вену (SVC) и трахею. Обрежьте их на ~3 мм выше основания сердца и соберите сердце вместе с соединенными легкими.
7. Погрузите собранные органы в коническую пробирку объемом 10 мл, содержащую 2 мл стерилизованного 30% раствора сахарозы. Дайте образцам обезвоживаться в течение 24 ч при температуре 4 °C.

3. Подготовка ЛХ и ФВ под контролем микроскопии

1. Поместите обезвоженное сердце и легкие в чашку для вскрытия, содержащую 40-50 мл 1x PBS. Поместите его под яркопольный микроскоп с 10-кратным увеличением и настройте освещение. Поместите сердце тыльной поверхностью на чашку для препарирования. Определите переход между желудочком и стенкой предсердий, и аккуратно отделите желудочки от предсердий с помощью хирургических ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте примерно на 1 мм ниже предсердий, чтобы сохранить часть желудочковой ткани. Это понадобится в дальнейшем для прикрепления предсердий к чашке для рассечения, не повреждая структуры у основания сердца. Мы рекомендуем оставить желудочки, так как они могут быть использованы в качестве положительного контрольного образца. Чтобы внедрить ткань желудочка, выполните ту же процедуру, что и для встраивания ФВ, как описано в разделе 4.
2. Поместите отделенные предсердия с режущей поверхностью желудочка (шаг 3.1) на чашку для препарирования так, чтобы основание сердца было обращено вверх. Сориентируйте предсердия так, чтобы доли легких находились кзадне, ЛД и левый придаток предсердия (ЛДА) находились справа, а правое предсердие (РА) и придаток правого предсердия (РА) находились слева. Зафиксируйте препарат, прикрепив оставшуюся ткань левого желудочка к чашке для вскрытия. Аккуратно разведите доли легких, не прилагая чрезмерных усилий, и прикрепите их к чашке для препарирования (рис. 1А).
3. Получите представление об анатомических ориентирах у основания сердца.
   1. Найдите аорту с дугой аорты в центре основания сердца.
   2. Определите легочный ствол (ЛТ) непосредственно справа от аорты и проследите его курс к задне, чтобы различить легочные артерии (ПА). Проверьте их местоположение, проследив их курс до левой доли и правой верхней/средней доли, чтобы найти соответствующую подвздошную кость легкого (ЛГ).
   3. Определите положение трахеи и/или левого и правого главных бронхов (L Br, R Br), которые расположены позади аорты, и проверьте их расположение, следуя их курсу к ЛГ (рис. 1A).
   4. Найдите SVC слева от аорты и убедитесь в этом, проследив за его курсом в RAA рядом с RAA.
4. Удалить соединительную и жировую ткань вокруг основания сердца, сохранив все выявленные ориентиры, упомянутые выше. Кроме того, удалите дугу аорты и трахею, чтобы иметь свободный обзор основания сердца (рис. 1B).
5. Аккуратно отделите ПА от верхней поверхности предсердия путем тупого рассечения с помощью тонких щипцов. После этого отрежьте их на ЛГ и отверните в сторону, чтобы обнажить левую стенку предсердий (LAFW) и PV в их полном размере. Отрезают главные бронхи от ЛГ и удаляют бронхиальную ткань (рис. 1В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: ЛГ служит как общей точкой входа для ПА и дыхательных путей в легкие, так и точкой выхода для ЛГ. Важно выполнять каждую процедуру на ЛГ осторожно, чтобы не повредить ПВ.
6. Чтобы отделить ЛП/РА и левый и правый желудочек (ЛЖ, ПЖ), выполняют разрез, начиная от передней части оставшегося ПЖ вверх через трехстворчатый клапан (ТВ) до передней стороны СВК, чтобы открыть РА с фронтальной стороны. Разрежьте заднюю свободную стенку РА (RAFW) рядом с межпредсердной перегородкой, чтобы разделить РА и LA. Разрежьте заднюю стенку правого желудочка рядом с межжелудочковой перегородкой, чтобы полностью разорвать ЛЖ и ПЖ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обширный протокол, подробно описывающий процедуру препарирования и изоляции правого предсердия, был опубликован ранее¹⁹. Разделение РА полезно для удаления нежелательной ткани из тканевого комплекса LA-PV и для сбора ткани для дополнительных экспериментов.
7. Уменьшите размер долей легких, отрезав часть базальной легочной ткани так, чтобы осталось примерно 3-4 мм легочной ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте верхушки долей легких, так как они служат поплавками на последующих этапах встраивания, и допускайте горизонтальное встраивание PV в соединение O.C.T.

4. Встраивание тканей

1. Перенесите препарат, включая LA и PV, в криоформу, убедившись, что основание сердца и верхушка легкого направлены вверх. Расположите их в физиологической конфигурации — убедитесь, что PV не перекручены и не перевернуты.
2. Заполните криомолд компаундом O.C.T и осторожно сожмите PV тонкими щипцами, чтобы удалить оставшийся воздух. Поддерживать их физиологическую конфигурацию неизменной на протяжении всего процесса.
3. Положите криомолд с внедренной тканью на сухой лед, чтобы заморозить соединение O.C.T. Храните образцы при температуре -80 °C для использования в будущем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно держать PV в горизонтальном положении, чтобы обеспечить получение секций, содержащих PV по всей длине, для последующих процедур.

5. Нарезка и сбор замороженных срезов ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Для резки блоков ткани настройки машины были настроены на температуру образца -18 °C и температуру лезвия -25 °C.

1. Установите тканевый блок на держатель образца, нанеся слой соединения O.C.T. между тканевым блоком и держателем образца. Заморозьте их на 3-4 минуты.
2. Заблокируйте головку образца и загрузите держатель образца тканевым блоком на головку образца, закрыв рычаг разблокировки патрона образца. Точно отрегулируйте положение тканевого блока с помощью ручек тонкой регулировки.
3. Извлеките криомолд из образца. Разблокируйте головку образца и электрический тормоз криостата.
4. Установите криостат в режим обрезки с размером обрезки от 30 мкм до 50 мкм. Обрежьте образец ткани до тех пор, пока PV не станут видимыми.
5. Переключитесь в режим резки тонких сечений и установите толщину 10 мкм. Начните собирать срезы, в том числе ВП и связанную ткань легких и предсердий. Соберите секции с помощью пластины для защиты от крена или прикрепив свободный конец каждой секции к держателю лезвия мелкой холодной щеткой и разложите их.
6. Расположите предметное стекло (при комнатной температуре) рядом с секцией. Осторожно снимите секцию с щетки, позволяя секции естественным образом прилипнуть к предметному стеклу, так как замороженная секция и соединение O.C.T. плавятся при прикосновении к более теплой поверхности предметного стекла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стабильное и щадящее состояние во время процесса секционирования, чтобы предотвратить любые разрывы или складки в секциях. При необходимости замените лезвие новым.
7. Соберите до трех разделов на каждом слайде. Маркируйте слайды и храните их при температуре -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем собрать не менее пяти разделов (эквивалентно двум слайдам) для каждого PV.

6. Иммунофлуоресцентное окрашивание криосекций из ФВ

1. Разложите замороженные предметные стекла на системе окрашивания и дайте участкам оттаять в течение примерно 20 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наполните систему окрашивания водой, чтобы образцы оставались влажными. Высыхание ткани может повредить антигены, вызывая артефакты неспецифического связывания антител и перекрашивания во время процедур окрашивания.
2. После 20 мин оттаивания покройте срезы несколькими каплями фиксирующего раствора (4% параформальдегид [PFA], табл. 1), чтобы зафиксировать ткань на предметных стеклах в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. После фиксации перенесите слайды на вертикальную стойку для слайдов и погрузите их в контейнер, наполненный 1x PBS. Поставьте емкость на шейкер на низкой скорости и мойте горки в течение 5 минут. Повторите этот цикл стирки еще два раза, каждый раз используя свежий 1x PBS.
4. После мытья обведите каждый отдельный участок на каждом предметном стекле ручкой-блокатором, содержащей ксилол. Переставьте предметные стекла на системе окрашивания и нанесите 1 или 2 капли раствора пермеабилизации (0,1% Тритон Х-100, таблица 1) на каждый образец с помощью пипетки Пастера. Дайте срезам инкубироваться при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы проникнуть в клетки и мембраны клеточных органелл.
5. После пермеабилизации удалите 0,1% раствор Triton X-100, промыв предметные стекла в течение 3 x 5 мин в 1x PBS, следуя той же процедуре, что описана в шаге 6.3.
6. После промывки переставьте предметные стекла на окрашивающей системе и нанесите 1 или 2 капли блокирующего буфера (таблица 1) на каждую секцию, убедившись, что они полностью покрыты блокирующим буфером. Дайте предметным стеклам инкубироваться в течение 1 ч при комнатной температуре.
7. Приготовьте 1 мл первичной смеси антител путем пипетирования 5 мкл мышиного антитела к цтротилу (разбавленного 1:200) и 1 мкл кроличьего антитела к Cx43 (разбавленного 1:1000) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, заполненную 994 мкл блокирующего буфера. Пипеткой проведите смесь вверх и вниз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество наносимой смеси антител в соответствии с размером секции. Убедитесь, что срезы полностью покрыты смесью антител. Концентрация, время инкубации и оптимальная температура инкубации антител могут варьироваться в зависимости от таких факторов, как тип антител, клоны антител и характеристики тканей. Мы рекомендуем тестировать и оптимизировать условия окрашивания индивидуально для каждого антитела.
8. После этапа блокировки (шаг 6.6) удалите оставшийся блокирующий буфер и непосредственно нанесите 2 или 3 капли смеси первичных антител на каждый участок. Дайте предметным стеклам инкубироваться в течение ночи при температуре 4 °C.
9. После первичной инкубации антител промывают предметные стекла в течение 3 х 5 мин промывочным буфером при легком встряхивании (Таблица 1).
10. Приготовьте 1 мл смеси вторичных антител путем пипетирования 1 мкл конъюгированного вторичного антитела к козьему антителу AF488 (разбавленного 1:1000) и 1 мкл конъюгированного вторичного антитела к козьему антикролику AF568 (разбавленного 1:1000) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, заполненную 998 мкл промывочного буфера. Пипеткой протрите смесь вверх и вниз, чтобы она хорошо перемешалась.
11. После этапа промывки (шаг 6.9) переставьте предметные стекла в системе окрашивания и нанесите пипеткой 2 или 3 капли смеси вторичных антител на каждый срез. Дайте антителам инкубироваться в течение 45 минут при комнатной температуре, защищая образцы от света, чтобы предотвратить тушение флуорофора. После инкубации вторичных антител промывают предметные стекла в течение 3 х 5 мин промывочным буфером при легком встряхивании (Таблица 1).
12. Переставьте предметные стекла на окрашивающей системе. Окрасьте срезы Hoechst-33342 (в разведении 1:1,000 в 1x PBS), нанеся 2-3 капли раствора Hoechst-33342 на каждую секцию. Дайте предметным стеклам инкубироваться в течение 10 минут при комнатной температуре.
13. После инкубации промывайте предметные стекла 3 x 5 мин промывочным буфером при легком встряхивании (Таблица 1). Установите предметные стекла, нанеся 1 или 2 капли флуоресцентного монтажного средства на каждое слайд. Накройте слайды покровными листами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При размещении покровного листа убедитесь, что он плоский. Если присутствуют пузырьки воздуха, осторожно надавите на боковую часть пузырька, чтобы удалить их.
14. Храните смонтированные слайды в заставке для слайдов при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется создавать изображения слайдов как можно раньше. Этот протокол действителен не только для упомянутых антител. Антигены-мишени и антитела могут быть заменены или модифицированы в соответствии с индивидуальными требованиями эксперимента или альтернативными стратегиями обнаружения антигенов.

7. Визуализация срезов иммунофлуоресцентного окрашивания

1. Настройте микроскоп.
   1. Запустите микроскоп с помощью лазерного источника света, подключенного компьютера и прилагаемого программного обеспечения, следуя руководству производителя.
   2. Войдите в меню Конфигурация . Нажмите, чтобы выбрать подходящий тип камеры для флуоресцентной визуализации (например, DFC365FX монохромную камеру).
   3. Войдите в меню «Получение» и создайте три канала.
   4. Выберите канал FCr1 для обнаружения Hoechst-33342, пометьте его и выберите куб фильтра DAP в разделе выбора. Установите время экспозиции на 200 мс, электронное усиление на 2 и интенсивность света на 17%.
   5. Выберите канал FCr2 для обнаружения cTNT (окрашенного конъюгированным антителом AF488), пометьте его и выберите куб фильтра L5 в разделе выбора. Установите время экспозиции 200-300 мс, электронное усиление 1,8 и интенсивность света 100%.
   6. Выберите канал FCr3 для обнаружения Cx43 (окрашенного конъюгированным антителом AF568), пометьте его и выберите куб фильтра TXR в разделе выбора. Установите время экспозиции на 150 мс, электронное усиление на 2 и интенсивность света на 100%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральные характеристики фильтровальных кубов приведены в таблице 2.
2. Загрузите предметное стекло на предметный столик микроскопа.
3. Выполните обзорную визуализацию с 10-кратным увеличением:
   1. Выберите объектив с 10-кратным увеличением и откройте лазерный затвор, нажав кнопку Live. Выбрав канал FCr1 , используйте функцию навигатора для навигации по слайду до тех пор, пока не будет обнаружен сигнал. Грубо сфокусируйте образец до тех пор, пока ядра клеток не станут различимы.
   2. Активируйте режим спирального сканирования , чтобы получить полный предварительный просмотр образца. Деактивируйте в реальном времени , нажав кнопку еще раз, чтобы защитить образец. Определите ЛП, ПВ и легочную ткань.
   3. Определите область интереса для последующего сканирования плитки; Выберите несколько точек фокусировки в области интереса. Нажмите Live ( Live) в канале FCr1 и отрегулируйте фокусировку для каждой точки фокусировки. Сохраните соответствующие Z-позиции, которые представляют собой точное положение фокусировки для каждой точки фокусировки. Запустите сканирование плиток с 10-кратным увеличением, чтобы получить полное общее изображение образца.
   4. После завершения сканирования откройте мозаичное сканирование и объедините отдельные изображения. Чтобы повысить яркость и контрастность отдельных каналов, выберите их на панели объектов и отрегулируйте диапазон сигнала с помощью ползунков.
4. Получение увеличенных изображений при 40-кратном увеличении:
   1. Выберите цель 40x. Отрегулируйте время экспозиции и настройки усиления для каждого канала следующим образом: FCr1: куб фильтра DAP: время экспозиции: 50 мс, усиление: 1,5; FCr2: куб фильтра L5: время экспозиции: 80 мс, коэффициент усиления: 1,8; FCr3: Куб фильтра TXR: время экспозиции: 20 мс, усиление: 2.
   2. Используйте обзорное изображение шага 7.3 для определения местоположения отверстия ФВ, а также внелегочной и внутрилегочной областей ВП (_{ВП ex}, ВВ). Определите эту область для сканирования.
   3. Откройте подменю Image и нажмите на z, чтобы активировать Z-Stack.
      1. Выберите канал FCr1 и откройте лазерный затвор для предварительного просмотра в реальном времени .
      2. Перейдите в подменю Z-Stack и определите начальную и конечную точки Z-Stack, вращаяручку точной регулировки по часовой стрелке и против часовой стрелки до тех пор, пока общий сигнал не начнет терять фокус.
      3. После настройки диапазона фокусировки выберите режим System Optimized Z-Stack ( Оптимизированный для системы Z-стек) и активируйте опцию вычисления изображений с расширенной глубиной резкости (EDF). В зависимости от того, насколько плоская ткань, ожидайте примерно 20 слоев с шагом примерно 0,5 мкм.
   4. Начните сканирование плитки. После сканирования откройте сканирование плиток и объедините только изображение EDF. Чтобы повысить яркость и контрастность отдельных каналов, выберите их на панели объектов и отрегулируйте диапазон сигнала с помощью ползунков (см. шаг 7.3.4).
5. После создания изображений сохраните проект и экспортируйте как объединенную версию, так и необработанные каналы каждого изображения в виде файла TIFF.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение файлов в формате TIFF, читаемом с помощью ImageJ, позволяет ImageJ импортировать исходный размер листа в мкм, а не в пикселях. Всегда закрывайте лазерный затвор всякий раз, когда лазерный сигнал не нужен, чтобы предотвратить фотообесцвечивание вторичных антител.

8. Редактирование изображений с помощью ImageJ

1. Загрузите соответствующие файлы необработанных каналов в ImageJ. Нажмите на изображение | Цвет | Объедините и выберите нужный цвет для каждого канала.
2. Создайте масштабную линейку, выбрав Анализ | Инструменты | Масштабная линейка и вставьте ее в правый нижний угол. Приступайте к дальнейшей обработке и анализу в соответствии с требованиями к изображению. По завершении сохраните объединенные изображения.

Результаты

Мы провели микродиссекцию, окрашивание и визуализацию ВП у 10 мышей в возрасте 12-16 недель. Следуя протоколу, мы успешно провели микропрепарирование ФВ вместе с ЛП у всех подопытных мышей и получили срезы с комплексным изображением ФВ у восьми мышей. Обзорные изображения были сделаны при ...

Обсуждение

С помощью этого протокола мы делимся методом различения и изоляции ВП сердца мыши и проведения на них иммунофлуоресцентного окрашивания. После забора органов сердце и легкие обезвоживали в стерилизованном растворе сахарозы с последующим отделением желудочков от предсердий и долей л?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287