Крысиная модель закрытой черепно-мозговой травмы легкой степени тяжести и ее валидация

Резюме

В данной работе мы представляем модель крысы с закрытой черепно-мозговой травмой (мЧМТ) и ее валидацию, демонстрирующую значительное сходство с ЧМТ человека в отношении поведенческих проявлений на острой и подострой стадиях.

Аннотация

Животные модели имеют решающее значение для углубления нашего понимания легкой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и руководства клиническими исследованиями. Для получения значимых выводов необходимо разработать стабильную и воспроизводимую модель животного. В этом исследовании мы сообщаем подробное описание модели мЧМТ с закрытой головкой и репрезентативный метод валидации с использованием крыс Спрэга-Доули для проверки эффекта моделирования. Модель предполагает сброс массы массой 550 г с высоты 100 см прямо на голову крысы на разрушаемой поверхности с последующим поворотом на 180 градусов. Чтобы оценить травму, крысы прошли серию нейроповеденческих оценок через 10 минут после травмы, включая время потери сознания, время первого поиска, способность к бегству и тест на способность балансировать на бревне. Во время острой и подострой стадий после травмы были проведены поведенческие тесты для оценки способности к координации движений (задание Beam), тревожности (тест Open Field), а также способностей к обучению и памяти (тест Morris Water Maze). Модель ЧМТ с закрытой головкой обеспечивала последовательную реакцию на травму с минимальной смертностью и воспроизводила реальные жизненные ситуации. Метод валидации эффективно верифицировал разработку модели и обеспечил стабильность и непротиворечивость модели.

Введение

Легкая черепно-мозговая травма (ЧМТ), или сотрясение мозга, является наиболее распространенным типом травмы и может приводить к различным кратковременным и хроническим^{симптомам1}. Эти симптомы могут включать головокружение, головные боли, депрессию и ангедонию, среди прочего, что приводит к значительным страданиям людей, страдающих ЧМТ². Поскольку большинство ЧМТ вызваны травмой тупым предметом3^, становится обязательным разработать модели животных, которые точно имитируют такие травмы. Эти модели необходимы для лучшего понимания травмы и лежащих в ее основе механизмов, предлагая контролируемую среду с меньшей вариабельностью и гетерогенностью по сравнению с исследованиями на людях.

Для черепно-мозговой травмы (ЧМТ) было разработано множество хорошо зарекомендовавших себя моделей грызунов, включая перкуссионное повреждение (FPI)⁴, контролируемое корковое воздействие (CCI)⁵, травму падением веса⁶, взрывную черепно-мозговую травму⁷ и другие. Однако эти модели в первую очередь ориентированы на воспроизведение сценариев ЧМТ средней и тяжелой степени. В отличие от этого, экспериментальные модели, специально разработанные для моделирования ЧМТ, привлекли относительно меньше внимания и остаются малоизученными⁸. Таким образом, существует острая необходимость в создании стабильной и воспроизводимой модели животных, которая точно представляет мЧМТ. Такая модель значительно расширила бы наше понимание нейробиологических и поведенческих последствий, связанных с ЧМТ.

Невозможно отличить функциональный дефицит у крыс с ЧМТ по сравнению с нормальными крысами при случайном наблюдении после того, как действие анестезии прошло. Поэтому необходимо проводить специфические тесты. У людей для оценки пациентов используется широкий спектр клинических оценок ^9,10,11. Аналогичным образом, создание успешной модели на крысах также требует использования инструментов быстрой оценки для определения ее валидности.

В этом исследовании мы представляем модель крысы с закрытой головой с мЧМТ, позволяющую исследовать мЧМТ способом, максимально приближенным к человеческому состоянию. Подробное описание модели и процедуры ее валидации дает всестороннее представление об экспериментальном подходе, используемом при изучении ЧМТ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию при Центрально-Южном университете. Все исследования проводились в соответствии с принципами благополучия и этики лабораторных животных.

1. Кормление и обезболивание животных

1. Групповое содержание 280-320 г крыс-самцов Спрэг-Доули и содержание их в цикле 12 ч/12 ч свет/темнота с доступом к пище и воде вволю. Исследование проводят после того, как крысы акклиматизируются в течение 6 дней.
2. Обезболивайте крысу 3% изофлураном при потоке воздуха 0,6 л/мин в индукционной коробке до тех пор, пока она не перестанет реагировать на пощипывание лапы или хвоста. Поддерживайте скорость потока в течение 30 с.
   Примечание: Обезболивающие препараты не использовались, так как они могли повлиять на реакцию крысы в нейроповеденческих оценках.

2. Предоперационная подготовка

1. Поместите губку с твердостью 35D (вес губки 35 кг/м3), одинаковой длины и ширины, но толщиной 12 см, в акриловую коробку (15 см x 22 см x 43 см) без верхней крышки.
2. Обрежьте оловянную фольгу (толщиной 20 мкм) и прикрепите ее к акриловой коробке с помощью клейкой ленты, чтобы сформировать разрушаемую поверхность, способную выдержать вес крысы. Кроме того, отметьте линию разреза размером примерно 10 см, чтобы она была обозначенным местом для размещения головы крысы.
3. С помощью железной подставки прочно закрепите трубку из ПВХ на месте. Приготовьте перфорированную гирю, весом 550 грамм с диаметром 18 миллиметров. Прикрепите груз к леске на высоте 1 метра внутри трубки из поливинилхлорида или ПВХ. и отрегулируйте положение направляющей трубки на 3 сантиметра выше фольги.
4. Подготовьте шлем и подушку. Сделайте шлем, используя диск из нержавеющей стали диаметром 10 мм и толщиной 3 мм. Подготовьте клиновидную губчатую подушку, чтобы положить ее под голову крысы, следя за тем, чтобы она была перпендикулярна направлению силы тяжести.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Принципиальная схема ударного аппарата представлена на рисунке 1. Шлем служит для определения места удара и улучшения распределения внешней силы. Подушка используется для обеспечения равномерного и стабильного повреждения.

3. Индукция ЧМТ

1. Быстро положите крысу под наркозом на грудь на оловянную фольгу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для индукции ЧМТ требуются два оператора - один для подготовки, а другой для верификации.
2. Подготовка: Подложите подушку под крысу, убедившись, что ее голова параллельна фольгированной бумаге. Совместите шлем с ушами крысы и закрепите его на месте.
3. Проверка: Убедитесь, что труба из ПВХ расположена прямо над шлемом. После того, как оба оператора подтвердят правильность настройки, переходите к следующему шагу.
4. Индукция вращения головы: отпустите груз, позволив ему упасть и ударить по голове крысы, вызвав падение на губку и поворот на 180°.
5. Положите крысу на спину в чистую клетку.

4. Фиктивная индукция

1. Относитесь к крысе так же, как и к предыдущему описанию индукции ЧМТ, но не подвергайте ее удару головой.

5. Процедура валидации: Острая нейроповеденческая оценка

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие оценки были изменены на основе шкалы неврологической тяжести⁹ и протокола Flierl et ^al.10. Все эти оценки проводили через 10 минут после того, как у крысы восстановился рефлекс выпрямления.

1. Время потери сознания: Запишите продолжительность с момента, когда крыса находится под наркозом, до момента, когда у нее восстанавливается рефлекс выпрямления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекс выпрямления - это процесс, при котором крыса переворачивается, когда ее кладут на спину. Потеря рефлекса выпрямления должна рассматриваться как гуманная конечная точка, и животное должно быть усыплено в соответствии с рекомендациями учреждения.
2. Время первого поискового поведения: Запишите время с момента, когда крыса находится под наркозом, до момента, когда она впервые демонстрирует поисковое поведение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поисковое поведение является признаком интереса к окружающей среде, физиологической реакцией.
3. Возможность побега
   1. Поместите крысу в середину круглого аппарата (диаметром 0,5 м и высотой 0,3 м) с выходом (длиной 12,5 см и шириной 9 см).
   2. Запишите время, необходимое крысе, чтобы выйти из круга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если крыса не выходит из круга в течение 180 с, запишите время как 180 с.
4. Испытание на способность к балансировке балки
   1. Поместите крысу на балку шириной 3 см, 2 см и 1,5 см на 1 минуту соответственно.
   2. Если крыса сохраняет равновесие с устойчивым положением на бревне, оценка равна 0.
   3. Если крыса ухватилась за боковую сторону балки, поставьте оценку 1. Если крыса обнимает бревно и одна конечность падает с него, оценивайте это как 2.
   4. Если крыса обнимает балку, и две конечности падают с нее или вращаются на ней (>60 с), оценивайте ее как 3.
   5. Если крыса пытается балансировать на бревне, но падает (> 40 с), оценивайте это как 4.
   6. Если крыса пытается балансировать на бревне, но падает (>20 с), оценивайте это как 5.
   7. Если крыса не пытается удержать равновесие или повиснуть на бревне и падает в течение 20 с, оценивайте ее в 6 баллов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Испытание баланса балки не требует предварительного испытания.

6. Процедура валидации: Оценка нейроповедения

Примечание: До проведения поведенческих экспериментов крыс обрабатывали в течение 2 минут ежедневно в течение 3 дней подряд, чтобы свести к минимуму стресс и нарушение новизны. Все поведенческие эксперименты проводились путем помещения животных в тестовую среду за 60 минут до начала эксперимента.

1. Координация движений (задание «Луч»)
   1. Экспериментальная установка
      1. Поместите крыс на один конец бревна (длиной 1,5 м и высотой 75 см над полом). Поместите на другой конец ящик для побега (домашнюю клетку с наклонной подстилкой).
      2. Расположите пенопластовую прокладку под балкой, чтобы снизить потенциальный риск травмирования крыс в случае падений во время испытания.
      3. Включите видеокамеру.
      4. Запланируйте дни тестирования в определенные моменты времени после травмы или после симуляции лечения (например, день 1, день 3 и день 7).
   2. Тренировочный этап (2 дня)
      1. Обучите крыс пересекать балку шириной 4 см 3 раза подряд, а затем два раза на балке шириной 2 см.
      2. Во время дрессировки осторожно направляйте крыс через балку до тех пор, пока они не смогут легко пересечь ее без помех.
   3. Эксперимент с балансиром
      1. Поместите крыс на балку шириной 2 см в течение 5 последовательных попыток.
      2. Записывайте начало и конец каждого испытания, когда нос крысы пересекает линию старта и финиша соответственно.
      3. Верните крыс в клетки по окончании эксперимента.
   4. Базовое тестирование
      1. Проведите эксперимент на бревне перед травмой или лечением.
      2. Рассчитайте средние значения из этих 5 последовательных испытаний, чтобы установить исходный уровень для каждой крысы.
   5. Анализ данных
      1. Проанализируйте время, необходимое для пересечения луча, и общее количество скольжений задней лапы с помощью видеоанализа, проведенного исследователями, не обращающими внимания на условия эксперимента.
2. Тревожность (тест в открытом поле)
   1. Экспериментальная установка
      1. Подготовьте арену для открытого поля, убедившись, что она чистая и без каких-либо предыдущих запахов. Разделите арену на три зоны: центральную внутреннюю зону (33 см х 33 см), среднюю зону (66 см х 66 см) и внешнюю зону.
   2. Этап тестирования
      1. Поместите крысу в центр арены открытого поля и запустите таймер. Дайте крысе свободно исследовать арену в течение 5 минут. Через 5 мин осторожно и аккуратно верните крысу в домашнюю клетку.
   3. Сбор данных
      1. Измерьте общее расстояние, пройденное крысой за 5-минутный период исследования. Определите время, которое крыса проводит в центральной внутренней, средней и внешней зонах.
   4. Анализ данных
      1. Используйте общее пройденное расстояние в качестве меры общего исследовательского поведения и двигательных способностей. Рассчитайте время, проведенное в центральной внутренней зоне, как показатель тревожных реакций.
3. Способность к обучению и памяти (тест водного лабиринта Морриса)
   1. Убедитесь, что устройство водного лабиринта находится в надлежащем состоянии. Покрасьте воду в черный цвет и расставьте кии по четырем сторонам света. Расположите платформу на 2,5 см ниже поверхности воды.
   2. Настройте систему мониторинга для записи и наблюдения за поведением крыс.
   3. Трейл-день
      1. Быстро поместите крысу в водный лабиринт. Если крыса не доберется до платформы в течение 2 минут, осторожно направьте ее деревянной палкой.
      2. Дайте крысе ознакомиться с окружением лабиринта, стоя на платформе в течение 20 секунд, затем уберите ее. Как только крыса окажется на платформе, дайте ей постоять 20 секунд, затем удалите ее.
   4. Ежедневное повторение
      1. Повторите процедуру тренировочного дня, помещая крысу в воду из разных квадрантов. Повторите шаг 6.3.3. Продолжайте тренировку в течение 5 дней подряд.
   5. Тестовый день с помощью зонда: На^6-й день снимите платформу и поместите крысу в тот же квадрант на 2 минуты.
   6. Наблюдение и запись: Используйте систему мониторинга для наблюдения за поведением крысы в дни испытаний и зондовых испытаний.
   7. Очистка: После извлечения крысы из водного лабиринта используйте полотенце, чтобы тщательно высушить ее.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Аппарат, использованный в этой работе, представлял собой модифицированную версию модели Кейна и педиатрической модели^11,12 Ришель Михасюк. В этом исследовании крысы SD были распределены в группы с симуляцией и ЧМТ. Чтобы продемонстрирова?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эта модель успешно имитирует ЧМТ с закрытой головкой без необходимости разреза кожи головы или вскрытия черепа, обеспечивая более точное представление сценария воздействия, наблюдаемого в случаях с людьми. Избегание разреза кожи головы помогает предотвратить воспалительные реакции,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic box	In-house	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine
Helmet	In-house	N/A	Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness
Morris water maze	RWD Life Science Co.		Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm
Open field	RWD Life Science Co.	63007	Width100 cm, height 40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
Perforated weight	In-house	N/A	Weight of 550 g and diameter of 18 mm
Pillow	In-house	N/A	Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head