Пространственный анализ высокого разрешения уровней экспрессии генов в сухожилиях

Резюме

В этой статье описывается, как выполнить оптимизированный протокол in situ для сухожилий. В этом методе обсуждается препарирование тканей, пермеабилизация среза, дизайн зонда и методы усиления сигнала.

Аннотация

В последние годы было разработано множество протоколов для транскриптомики высокого разрешения во многих различных областях медицины и биологии. Тем не менее, богатые матриксом ткани, в частности сухожилия, были оставлены из-за их малого количества клеток, низкого количества РНК на клетку и высокого содержания матрицы, что затрудняло их анализ. Одним из последних и наиболее важных инструментов для работы с одиночными клетками является пространственный анализ уровней экспрессии генов в сухожилиях. Эти пространственные инструменты РНК имеют особенно большое значение для сухожилий для определения местоположения конкретных клеток новых и неизвестных популяций, проверки результатов секвенирования РНК-клеток одиночных клеток и добавления гистологического контекста к данным секвенирования РНК одиночных клеток. Эти новые методы позволят проводить анализ РНК в клетках с исключительной чувствительностью и обнаруживать одномолекулярные РНК-мишени на уровне одной клетки, что поможет молекулярно охарактеризовать сухожилия и будет способствовать исследованию сухожилий.

В этой методической статье мы сосредоточимся на доступных методах анализа пространственных уровней экспрессии генов на гистологических срезах с использованием новых тестов гибридизации in situ для обнаружения целевой РНК в интактных клетках на уровне одиночных клеток. Во-первых, мы сосредоточимся на том, как подготовить ткань сухожилия к различным доступным анализам и как усилить сигналы, специфичные для мишени, без фонового шума, но с высокой чувствительностью и высокой специфичностью. Затем в статье будут описаны конкретные методы пермеабилизации, различные конструкции зондов и стратегии усиления сигнала, доступные в настоящее время. Эти уникальные методы анализа уровней транскрипции различных генов в разрешении одиночных клеток позволят идентифицировать и охарактеризовать клетки сухожильной ткани в молодых и пожилых популяциях различных животных моделей и тканей сухожилий человека. Этот метод также поможет проанализировать уровни экспрессии генов в других богатых матриксом тканях, таких как кости, хрящи и связки.

Введение

Сухожилия – это соединительные ткани, которые обеспечивают передачу силы между мышцами и костью¹. В процессе развития осевые теноциты происходят из мезенхимальных клеток в склеротоме сомитов²; сухожилия конечностей отходят от мезодермы латеральной пластины; а краниальные сухожилия возникают из линии черепного нервного гребня ^3,4. Сухожилие может характеризоваться экспрессией транскрипционного фактора⁵ склеракс, хотя несколько маркеров также играют ключевую роль в развитии сухожилий, включая теномодулин, ирокез и раннюю реакцию роста 1/2 6,7,8,9.

Несмотря на небольшое количество известных маркеров сухожилия, в целом, более глубокая характеристика сухожилия остается сложной задачей, поскольку сухожилие содержит клетки, которые охватывают градиент биомеханических свойств. От миотендинозного соединения, сухожильного среднего тела и более кальцинированного энтезиса сухожильные клетки находятся во внеклеточных матрицах, которые различаются по свойствам растяжения. Поскольку сухожилие должно выдерживать растягивающее напряжение, вызванное разницей в механической прочности между мягкими и твердыми тканями, пространственная организация клеток в сухожилии особенно важна для его функции. Тем не менее, мало что известно об этих субпопуляциях сухожилий.

Для начала выяснения субпопуляций клеток можно использовать множество пространственных транскриптомных инструментов с высоким разрешением, включая, помимо прочего, Seq РНК одиночных клеток или гибридизацию in situ . Однако, хотя эти анализы пространственного профилирования помогают выявить экспрессию РНК в ткани после микродиссекции или разреза, эти методы могут быть сложными при выполнении на сухожильной ткани. Сухожилия представляют собой богатые матриксом ткани, состоящие почти на 86% из коллагена по сухой^массе10, что затрудняет извлечение клеток для секвенирования. Из-за сложностей при выделении клеток из матрикса, гипоклеточной природы сухожилия¹¹ и относительно низкого количества РНК, сухожилие является сложной тканью для анализа.

В этой статье мы представляем метод оптимизации новых тестов гибридизации in situ для их использования для сухожилий путем предоставления методов подготовки тканей, пермеабилизации и дизайна зондов. В сочетании с существующими технологиями секвенирования это может помочь исследователям пространственно охарактеризовать субпопуляции сухожилий у развивающихся, взрослых или поврежденных сухожилий с повышенной чувствительностью и специфичностью анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) и AAALAC. Эксперименты проводились в соответствии с утвержденным протоколом #2013N000062 в Массачусетской больнице общего профиля. В этом исследовании использовались мыши C57BL/J6 (в возрасте 5 недель и P0). Подробные сведения обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Пробоподготовка и фиксация

1. Усыпляйте мышей в камере_CO2 с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичного метода эвтаназии. Затем с помощью ножниц разрежьте задние конечности мыши вдоль тазобедренного сустава¹². В сцинтилляционный флакон погрузите заднюю конечность мыши в достаточное количество 4% раствора параформальдегида (PFA), чтобы полностью покрыть образец, и зафиксируйте ткань на 24 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо 4% PFA для фиксации также можно использовать 10% формалин. После фиксации образец может храниться в фосфатно-солевом буфере (PBS) до дальнейшей обработки. Фиксируя всю заднюю конечность, мы можем сохранить напряжение на сухожилии и имеем возможность исследовать энтезис, сухожилие в средней части тела или миотендинозное соединение.
2. После извлечения PFA из сцинтилляционного флакона промойте образец в течение 3 x 10 минут 1x PBS, добавив достаточное количество PBS, чтобы покрыть образец. Затем погрузите задние конечности в 0,5 М ЭДТА при температуре 4 °С с перемешиванием в течение 1-2 недель, заменяя на свежие ЭДТА каждые 2-3 дня.
3. После удаления ЭДТА промойте образец в течение 3 x 10 минут с помощью 1x PBS, обезвожьте образцы в 70% EtOH и погрузите их в парафин в желаемой ориентации. Используйте традиционные методы среза FFPE для разреза ткани толщиной 3 мкм и переноса срезов на обработанное заряженное предметное стекло микроскопа (см. Таблицу материалов)¹³.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы можно хранить при температуре 4 °C перед переходом к следующим этапам.
4. Депарафинизация
   1. Выпекайте предметные стекла на горячей плите при температуре 60 °C в течение 1 часа, а затем дайте предметным стеклам нагреться до комнатной температуры (RT). Чтобы удалить парафин со слайдов, поместите слайды на решетку для слайдов и опустите их в тарелку для окрашивания, наполненную ксилолом. Повторите в свежем ксилоле в течение 3 х 5 минут.
      ВНИМАНИЕ: Ксилол опасен; Обращайтесь с осторожностью.
   2. Чтобы увлажнить секции, погрузите предметные стекла в следующие виды на 5 минут за промывку, все при RT: простирайте 2 раза в 100% EtOH, 1x в 75% EtOH, разбавленном в dH₂O, 1x в 50% EtOH, разбавленном PBS, 1x в 25% EtOH, разбавленном в PBS, и 2x в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы регидратации выполняются с помощью слайдов на решетке для слайдов и с помощью различных растворов EtOH при окрашивании посуды.

2. Адаптация протокола 14 к RNAscope (коммерциализированному ISH)

1. Подготовка растворов и зондов
   1. Готовят раствор ТЭГ для предварительной обработки срезанных образцов путем соединения 25 мМ Трис-HCl при рН 8, 10 мМ ЭДТА и 50 мМ глюкозы. Сделайте достаточный объем для обработки всех образцов или заготовьте излишки; фильтровать-стерилизовать и хранить при РТ; Перед использованием раствор тщательно перемешать.
   2. Подготовьте достаточное количество буфера для стирки 1x (см. Таблицу материалов) для всех стирок и храните его при RT.
   3. На водяной бане или в инкубаторе при температуре 40 °C прогрейте интересующие зонды в течение 10 минут. Затем подготовьте зонды в соответствии с протоколом ISH¹⁴.
2. Предварительная обработка образцов
   1. Вместо использования рекомендованного раствора для предварительной обработки погрузите предметные стекла в чашку для окрашивания, содержащую буфер TEG, на 4 часа при температуре 60 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация буфера ТЭГ может быть продлена на срок до 6 часов, если ткань особенно плотная или если извлечение антигена из интересующего вас мотива связывания РНК является сложной задачей. В этом случае здесь можно добавить точку остановки, высушить предметные стекла и хранить их в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи.
   2. Извлеките образцы из буфера и дайте им высохнуть. Затем обведите образцы гидрофобной барьерной ручкой, погрузите их в другую чашку для окрашивания, содержащую протеазу IV, и инкубируйте в духовке в течение 45 минут при 40 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем протеазу внутривенно для взрослых мышей. При использовании более молодых мышей, таких как P0, мы рекомендуем использовать более мягкий фермент, такой как протеаза III, в течение 30 минут. При устранении неполадок для разных возрастов наблюдайте за целостностью сухожилия и проверяйте на деградацию. Если ткань диссоциирует или деградирует, уменьшите время инкубации или измените используемую протеазу.
   3. Снова промойте образцы в буфере TEG в течение 30 минут, а затем гибридизируйте зонды в соответствии с протоколом ISH¹⁴.
   4. Добавьте 50-100 мкл монтажного реагента поверх образца. Наденьте покровное стекло поверх образцов для микроскопии. При съемке используйте большое увеличение (объектив 40x или выше) для просмотра сигнала.

3. Адаптация протокола HCR ISH¹⁵

1. Постфиксация
   1. Приготовьте 4% PFA (в PBS), раствор PBT (0,1% Tween-20 в PBS) и протеиназу K в PBS (исходная концентрация 10 мг/мл, конечная концентрация 5 мкг/мл).
   2. Для начала первого постфиксного шага погрузите предметные стекла в посуду для окрашивания, содержащую 4% ПФА, на 5 минут; затем удалите 4% раствор PFA и храните его для использования на последующих этапах. Промойте предметные стекла в течение 2 х 5 минут в растворе PBT и удалите раствор PBT. Поместите предметные стекла в форму для окрашивания, содержащую раствор протеиназы К (5 мкг/мл) на 5 минут и промойте их в растворе PBT 2 x 5 минут.
   3. Начните второй этап постфиксации и погрузите предметные стекла в 4% PFA на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это те же 4% PFA, которые были сэкономлены на шаге 3.1.2.
   4. Промойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в растворе PBT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы постфиксации выполняются с помощью предметных стекол на решетке для слайдов и в окрашивании посуды, содержащей соответствующие растворы.
2. Ацетилирование
   1. Приготовьте раствор ацетилирования, содержащий 625 мкл ангидрида уксусной кислоты, 3,3 мл буфера 1 М триэтаноламин (TEA) и 246 мл ddH₂O. Обязательно хорошо перемешайте и используйте сразу после приготовления.
   2. Поместите предметные стекла в раствор ацетилирования на 10 минут, а затем промойте 3 x 5 минут в растворе PBT. Промойте предметные стекла в ddH₂O и дайте им высохнуть на воздухе в течение 30 минут. Затем обведите образцы гидрофобной барьерной ручкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы ацетилирования выполняются с помощью предметных стекол на решетке для слайдов и при окрашивании посуды, содержащей соответствующие растворы
3. Гибридизация
   1. Разогрейте буфер для гибридизации до 37 °C и прогрейте увлажненную камеру до 37 °C.
      ВНИМАНИЕ: Буфер содержит формамид, опасный материал. Если предметные стекла недостаточно сухие, промокните края лабораторной салфеткой, чтобы удалить излишки dH₂O.
   2. Приготовьте зондовые растворы, добавив 0,4 пмоль каждой смеси зондов в 100 мкл буфера для гибридизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании визуализации dHCR используйте более высокую концентрацию зонда для повышения эффективности гибридизации зонда.
   3. Приготовьте 4 л буфера цитрата натрия хлорида натрия (20x SSC), смешав 3 М NaCl (701,1 г NaCl в конечном объеме 4 л) и 0,3 М M Na₃CH₆H₅O₇•2H₂O (352,8 г), а затем отрегулируйте окончательный pH до 7 путем добавления HCl или 10 N NaOH. Добавьте достаточное количество H₂O, чтобы получить 4 л. Приготовьте 5x SSCT, разбавив 20x SSC до 5x и добавив достаточное количество 10% Tween 20, чтобы оно составило 0,1% от общего объема.
   4. Добавьте в образец 200 μл буфера для гибридизации, поместите предметные стекла в увлажненную камеру и дайте предметным стеклам инкубироваться в течение 10 минут. Удалите раствор для гибридизации и слейте лишний буфер на предметном стекле, промокнув края лабораторной салфеткой.
   5. Добавьте 100 μл приготовленного раствора зонда поверх образца и наложите на образец покровную крышку. Выдерживать в духовке в течение ночи или в течение 12-16 часов в камере, увлажненной раствором, содержащим 5x SSC и 50% формамид. Установите температуру на 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку инкубация происходит в течение ночи, добавление покровного стекла необходимо свести к минимуму испарение.
   6. Оставьте аликвоту 5x раствора SSCT на водяной бане при температуре 37 °C, а вторую аликвоту при RT. Предусмотрите необходимые объемы этих аликвот на основе количества образцов и количества стирок на следующем этапе.
4. Стирка
   1. Используя предварительно нагретый раствор 5x SSCT, приготовьте 75% буфер для стирки / 25% 5x SSCT, 50% буфер для стирки / 50% 5x SSCT и 25% буфер для стирки / 75% 5x SSCT.
   2. Чтобы удалить излишки щупов, погрузите предметные стекла последовательно на 15 минут за промывку при температуре 37 °C в 75% буфер для стирки/25% 5x SSCT, 50% буфер для стирки/50% 5x SSCT и 25% буфер для стирки/75% 5x SSCT. Дайте покровным листам отплыть от образцов.
   3. Инкубируйте предметные стекла 2 x 15 минут со 100% 5x SSCT, а затем погрузите их в 5x SSCT на 5 минут при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы мытья можно выполнять с помощью предметных стекол на решетке для слайдов и при окрашивании посуды, содержащей соответствующие растворы или добавленные растворы в виде капель.
5. Усиление
   1. Приготовьте 6 пмоль шпильки h1 и 6 пмоль шпильки h2 путем мгновенного охлаждения 2 мкл 3 мкМ материала (нагрейте при 95 °C в течение 90 с и охладите до температуры RT). Во время этого процесса беречь шпильки от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шпильки HCR h1 и h2 поставляются в буфере для хранения шпилек и готовы к мгновенному охлаждению. Защелкните охлажденные шпильки h1 и h2 в отдельных пробирках.
   2. Высушите предметные стекла, промокнув их края лабораторной салфеткой. Затем добавьте 200 мкл амплификационного буфера поверх образца и поместите его в увлажненную камеру на 30 мин при RT. Приготовьте смесь шпилек, добавив шпильки с защелкой h1 и шпильки с защелкой h2 с защелкой к 100 мкл буфера для амплификации при RT.
   3. Снимите буфер для усиления и слейте лишнюю жидкость с предметного стекла, промокнув края лабораторной салфеткой. Добавьте 100 μЛ приготовленной ранее шпильной смеси и положите поверх образца парапленку. Инкубируйте предметные стекла в течение не менее 4 часов или в течение ночи в темной, увлажненной камере в режиме RT.
   4. Чтобы удалить лишние шпильки, погрузите предметные стекла в 5x SSCT в форму для окрашивания и выдерживайте при RT в течение 30 минут. Повторите стирку в свежем 5x SSCT в течение 30 минут, а третий раз в течение 5 минут.
   5. Высушите предметные стекла, промокнув края лабораторной салфеткой, и добавьте 50-100 мкл монтажного реагента поверх образца. Наденьте покровное стекло поверх образцов для микроскопии. При съемке используйте большое увеличение (объектив 40x или выше) для просмотра сигнала.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 1: Экспрессия Poly A РНК в ахилловом сухожилии взрослой мыши с помощью RNAScope. Репрезентативное изображение успешного мечения Poly A в ахилловом сухожилии мыши (левая пане?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой статье мы описываем модификации, сделанные для использования существующих инструментов ISH таким образом, чтобы их можно было использовать в сухожильной ткани с высокой степенью специфичности и чувствительности. Поскольку сухожилие является тканью с высокой п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M triethanolamine buffer
10% Formalin solution
10% Tween-20
20x Saline Sodium Citrate buffer
4% PFA
ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V2	ACD	323100
Acetic Anhydride
Axio Imager Microscope	ZEISS
C57BL/J6 mice		JAX ID: 000664
Coverslips	Fisher	12-541-042
ddH2O
ETDA	Thermofisher	AM9262
EtOH
Glucose	VWR Chemicals BDH	BDH9230-500G
HCR RNA-FISH Bundle	Molecular Instruments Inc.
HybEZ II Hybridization System	ACD
Immedge Barrier Pen	Vector Laboratories	H4000
Leica SPE Confocal Microscope	Leica
Parafilm	Fisher
Phosphate-buffered saline (PBS, 1x)	Invitrogen	AM9625	Dilute 10x PBS in milli-Q water to get 1x solution
Protease IV
Proteinase K	Roche	3115836001
RNAscope H2O2 and Protease Reagents	ACD	PN 322381	Included in ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V3
RNAscope Multiplex Fluorescent Detection Kit	ACD	PN 323110	Included in ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V2
RNAscope Target Retrieval reagents	ACD	322000	Included in ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V4
RNAscope Wash Buffer	ACD	PN 310091	Included in ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V5
RNAscope Probe Diluent	ACD	300041
Slide holder	StatLab	4465A
Staining Dish with Lid	StatLab	LWS20WH
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher	1255015	treated, charged slides
Tris-HCl
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L