JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает внутрибедренное введение нескольких гемопоэтических или лейкозных стволовых клеток, включая генетически отредактированные клетки, в мышиные модели ксенотрансплантата, что позволит не только быстро и безопасно пересадить клетки, но и провести серийный анализ костного мозга.

Аннотация

Несмотря на сложность трансплантации гемопоэтических клеток у человека, исследователи обычно проводят внутривенные или внутрибедренные инъекции мышам. На мышиных моделях этот метод был адаптирован для повышения эффективности посева трансплантированных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСК). В данной статье подробно описана пошаговая техническая процедура инъекции ПЧ и последующей аспирации костного мозга (КМ) у мышей, что позволяет провести серийную характеристику клеток, присутствующих в БМ. Этот метод позволяет пересаживать ценные образцы с низким количеством клеток, которые особенно трудно приживить путем внутривенной инъекции. Эта процедура способствует созданию ксенотрансплантатов, которые имеют решающее значение для патологического анализа. Несмотря на то, что доступ к периферической крови (ПГ) легче, клеточный состав ПБ не отражает БМ, которая является нишей для ГСК. Поэтому процедуры, обеспечивающие доступ к отсеку БМ, имеют важное значение для изучения кроветворения. Инъекция ПЧ и последовательная аспирация БМ, как описано здесь, позволяют проводить проспективное извлечение и характеристику клеток, обогащенных БМ, таких как HSPC, без ущерба для мышей.

Введение

Система крови поддерживается на протяжении всей жизни гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК), которые находятся в костном мозге (КМ)1,2. Для изучения динамических изменений в среде КМ важно понимать биологию как нормального, так и злокачественного кроветворения 3,4. Трансплантация ГСК непосредственно в КМ человека дает более высокую степень приживления, чем инфузия периферической крови (ПГ), но высокая сложность процедуры и повышенный риск инфицирования исключают этот метод из стандартной практики5. У мышей процедуры, которые облегчают доступ к КМ без ущерба для животных, обеспечивают ресурс для последовательного мониторинга кроветворения. Описанная методика направлена на получение мышей с высокой степенью приживления трансплантированных клеток и обеспечение возможности серийного отбора проб КМ живых мышей. В данной статье речь пойдет о создании моделей ксенотрансплантатов с использованием иммунодефицитных мышей, привитых человеческими клетками, которые сложнее в производстве, чем модели аллотрансплантации мышей и мышей. По сравнению с обычной трансплантацией гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСКГ) через хвост или ретроорбитальную вену, преимущества этой процедуры заключаются в высокой клеточности приживления при малом количестве исходного материала.

Несмотря на то, что внутрибедренная (ИФ) клеточная инъекция в полость КМ мышей обычно используется для изучения ГСКХ человека in vivo 6,7,8, формальная пошаговая процедура, иллюстрирующая/снимающая этот метод, ранее не публиковалась. Этот протокол обеспечивает высокую степень приживления из небольшого числа трансплантированных клеток и механизм серийного отбора образцов БМ. Кроме того, с помощью этого метода можно проанализировать влияние введения инъекционных препаратов непосредственно в полость КМ на лечение заболеваний крови. Описанная здесь процедура помогает получить доступ к КМ, где находятся кроветворные клетки, не жертвуя мышами.

Этот протокол аналогичен методике, используемой для аспирации КМ9. Ключевое отличие заключается в том, что в этой статье и прилагаемом к ней видеопротоколе подробно описана безопасная процедура введения клеток в костный мозг, в то время как в предыдущих работах клетки трансплантировались через вену, а затем выполнялась серийная аспирация КМ. Этот протокол обеспечивает успешное приживление с небольшим количеством клеточной линии (Рисунок 1), нормальных ГСК, полученных из пуповинной крови (СВ) (CD34+) (Рисунок 2) и ГСК (CD34+CD38-CD45RA-CD90+) (Рисунок 3), нормальных ГСК, полученных из КМ (CD34+CD38-) (Рисунок 4), лейкозных стволовых клеток, полученных от пациента (CD34+CD38-) (Рисунок 5), нормальных ГСКХ, полученных из КБ с редактированием гена CRISPR/Cas9 (CD34+) (Рисунок 6) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)-иПСК (Рисунок 7). В частности, для нормальных ГСК, полученных из пуповинной крови, мы смогли успешно провести приживление всего с 10 клетками. Этот метод особенно ценен для экспериментов, проводимых с редкими или трудно генерируемыми клеточными популяциями, такими как немодифицированный или генетически отредактированный первичный острый миелоидный лейкоз человека или клетки CB. Кроме того, эта процедура описывает эффективный метод серийного анализа приживленных клеток, который может быть немедленно использован в последующих экспериментах. Чтобы избежать потери ценных образцов и обеспечить инъекцию ПЧ, мы также кратко описали здесь методику10 на основе Акалуца, чтобы помочь укрепить эту технику.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Шести-десятинедельный кобель или сука НОД. В этом протоколе использовались мыши Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), но он может быть применен ко всем типам мышей. Облучение зависит от экспериментального содержания и вида мышей, облучать мышей или нет – зависит от целей исследования. Все описанные здесь процедуры на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию и были одобрены Административной комиссией Стэнфордского университета по уходу за лабораторными животными (APLAC #22264). Все нормальные популяции клеток крови были отсортированы свежими. Образцы ОМЛ у человека были получены от пациентов Стэнфордского медицинского центра с информированного согласия, в соответствии с протоколами, одобренными Институциональным наблюдательным советом (IRB) (Stanford IRB, 33818).

1. Внутрибедренное введение клеточных линий, гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСК) или лейкозных стволовых клеток (ЛСК)

Примечание: Для легкого анализа введенных клеток с помощью устройства визуализации была сгенерирована клеточная линия K562 Akaluc/tdTomato-положительной, а в качестве субстрата10 был использован AkaLumine-HCl/Akaluc. Если оборудование для визуализации недоступно, клетки могут быть помечены флуоресцентным красителем лентивирусом или PiggyBac и проанализированы с помощью проточной цитометрии. Независимо от деталей клеточного препарирования, наличие способа доказательства того, что клетки, введенные в костный мозг, надежно проникли в БК, имеет важное значение для совершенствования этой методики (рис. 1).

  1. Приготовьте клеточные суспензии (до 3 × 106 клеток крови) с 20 мкл буфера для сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) (фосфатно-солевой буфер (PBS) + 2% фетальная бычья сыворотка (FBS) + 2 мМ ЭДТА) или среду для размораживания (IMDM + 20% FBS + Pen/Strep) в ПЦР или 1,5 мл пробирок и держите на льду перед инъекцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха во время подвешивания клеток с помощью иглы. Пузырьки следует удалить как можно больше непосредственно перед инъекцией, так как введение пузырьков воздуха может вызвать внезапную смерть мышей.
  2. Кондиционирование взрослых мышей в возрасте 6-10 недель с концентрацией 200 сГр (225 кВ, 13,3 мА, всего 2 Гр [режим контроля дозы]) за 48 ч до введения клеток.
  3. Во-первых, обезболите мышей ингаляцией изофлурана в индукционной камере и поддерживайте уровень изофлурана на уровне 2% в 100% кислороде со скоростью потока 1-2 л/мин через носовой конус для достижения устойчивого состояния анестезии. Проверяйте глубину анестезии с помощью рефлекса щипкового пальца ноги и медленного, ровного дыхания, и поддерживайте это состояние на протяжении всей процедуры изофлурана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте глубину анестезии каждые 3-5 минут на протяжении всей процедуры, чтобы убедиться в отсутствии изменений частоты сердечных сокращений и дыхания при хирургических манипуляциях и/или щиплении ушей, пальцев ног и хвоста. В качестве индикатора насыщения кислородом можно использовать цвет слизистых оболочек и кожи, так как они будут розоватыми, если мыши будут в хорошем состоянии. Соблюдайте осторожность при наложении на мышь непрозрачных простыней, так как не всегда можно увидеть, что происходит с мышью.
  4. Перед процедурой вводите мышам подкожно карпрофен в дозе 10 мг/кг, чтобы свести к минимуму боль, и согрейте 0,5-1,0 мл 0,9% физиологического раствора для поддерживающей терапии.
  5. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши, чтобы избежать пересыхания роговицы.
  6. Держите мышь на грелке или другой термостатируемой поверхности, чтобы предотвратить переохлаждение во время процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После процедуры используется грелка с регулируемой температурой. Температура тела мыши обычно составляет 37-39 °C, и в идеале коврик должен быть немного ниже. На практике температуру часто устанавливают на уровне 32-36 °C.
  7. Продезинфицируйте всю ногу, содержащую бедренную кость, с помощью трех наборов чередующихся скрабов (чередуя либо с повидон-йодом, либо со скрабом с хлоргексидином и марлевыми губками, пропитанными на 70% этанолом).
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Если оператор левша, левую бедренную кость мыши может быть легче ввести, чем правую бедренную кость. 2) В данном исследовании мех не удалялся для инъекций, чтобы избежать ненужного повреждения кожи, а место введения иглы можно легко найти, не срезая мех. Однако у мышей с темным мехом может быть сложно найти место прокола, и в этом случае рассмотрите возможность срезания шерсти, так как начать инъекцию можно быстро и легко.
  8. Аккуратно сожмите бедренную кость большим и указательным пальцами, чтобы стабилизировать ногу. Надавите на большеберцовую кость безымянным или пятым пальцем, чтобы большеберцовая кость была согнута от бедренной кости. Позиционирование имеет важное значение для успешной инъекции (дополнительный рисунок S1-S5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте щипцы для защемления кости, чтобы предотвратить травмирование пальцев; Тем не менее, может быть трудно прощупать стержень бедренной кости, что добавит времени к процедуре.
  9. Вставьте пустую стерильную иглу 27 G (1/2 дюйма) с прикрепленным шприцем прямо под сухожилие надколенника так, чтобы игла надежно застряла между двумя мыщелками бедренной кости. Используйте край иглы и слегка проклейте сухожилие надколенника на верхней части бедренной кости пару раз, чтобы найти лучшее место для введения иглы (дополнительный рисунок S1-S5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выполнением этой процедуры необходимо знание анатомии коленной области мыши. Новички должны потратить время на то, чтобы понять анатомию этой области и попрактиковаться в процедуре на усыпленной мыши, прежде чем пытаться сделать это на живой мыши.
  10. Поверните иглу наружу и вверх, чтобы она была параллельна стержню бедренной кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот маневр обеспечивает надежный путь к полости костного мозга, облегчает извлечение содержимого костного мозга из бедренного ствола и сводит к минимуму дискомфорт для животного от процедуры.
  11. Поворачивайте иглу по кругу, медленно продвигаясь в полость бедренного мозга. Вводите иглу до тех пор, пока не произойдет заметное снижение сопротивления. Подтвердите правильное положение иглы, осторожно переместив шприц в сторону. Если есть возможность коснуться края иглы пальцами, выходящими за пределы кости, вернитесь к шагу 1.9 и найдите другой угол и место для сверления иглы.
    1. Убедитесь, что угол входа иглы перпендикулярен торцевой поверхности кости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теоретически игла должна вводиться параллельно бедренной кости и должна находиться под углом 90° к концам кости. Если есть сопротивление со стороны внутренней поверхности, игла была правильно размещена в бедренной полости. Чтобы убедиться, что игла параллельна кости, поместите фонарь сбоку от кости и наблюдайте за тенью кости, параллельной стержню иглы. Снижение резистентности при входе в полость костного мозга зависит от возраста мыши: чем моложе мышь, тем легче распознать снижение резистентности.
  12. Создайте отрицательное давление, осторожно потянув поршень иглы назад, перемещая иглу вперед и назад в полости BM. Если игла находится в полости БМ, некоторое количество крови/костного мозга выйдет из шприца.
    1. Если кровь/костный мозг не видны, пересядьте на новую иглу и попытайтесь найти тот же путь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Причина перехода на новую иглу заключается в том, что как только кость забивает иглу, становится трудно проверить обратный ток крови/костного мозга. Сведение к минимуму количества путей введения в полость КМ имеет решающее значение, поскольку клетки, вводимые в костный мозг, могут просачиваться из бедренной кости через предыдущие точки входа. Если необходимо несколько путей инъекции, риск утечки можно снизить, вводя клетки постепенно, а не быстро болюсно.
  13. Медленно извлеките иглу и введите шприц, содержащий клетки, тем же путем. Постарайтесь ввести иглу до упора (на краю полости БМ) и немного оттянуть (на 1-2 мм) оттуда, чтобы легко вводить клетки. Прежде чем нажимать на поршень и отпускать клетки, слегка аспирируйте и проверьте наличие крови/костного мозга, чтобы убедиться в правильном размещении иглы. Сначала проверьте обратный ток крови/костного мозга, а затем медленно нажимайте на шприц, чтобы ввести клетки.
    ПРИМЕЧАНИЯ: Очень важно помнить о маршруте и угле первой инъекции при переходе на новую иглу. Если тот же маршрут не может быть найден, повторите попытку с оригинальной иглой, использованной для построения первого маршрута. В это время можно использовать новую иглу, но если используется оригинальная игла, застрявшую кость следует вытолкнуть один раз перед использованием. Не используйте иглу с клетками, чтобы найти новый путь для инъекции; В противном случае кусочки кости, застрявшие в игле, могут помешать рассеиванию клеток. Несмотря на то, что полость БМ очень мала, объем инъекции должен быть менее 30 мкл, учитывая мертвую полость.
    1. Следите за тем, чтобы скорость инъекции была низкой, чтобы предотвратить попадание воздуха из шприца в костный мозг и предотвратить утечку клеток из места прокола. Если при нажатии на шприц ощущается сопротивление, перемещайте иглу вверх и вниз, чтобы найти менее устойчивый участок в полости.
  14. После того, как клетки будут успешно введены в бедренную кость, извлеките иглу и шприц из мыши, сохраняя давление на шприц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите попытку с другой бедренной костью, если инъекция не может быть завершена. Процедура очень стрессовая для мыши, даже под наркозом. Всегда следите за жизненными показателями мыши (сердцебиение и частота дыхания) и постарайтесь закончить процедуру как можно скорее.
  15. Снимите мышь с носового конуса и положите ее на чистое бумажное полотенце, чтобы предотвратить аспирацию подстилки. Во время восстановления держите мышь на грелке или другой поверхности с термостатическим контролем. Наблюдайте за всеми мышами, чтобы убедиться в восстановлении после анестезии, прежде чем положить их обратно на стойку для мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После аспирации не должно быть осложнений или дистресса, если она проведена правильно. Процедура будет завершена, когда мыши, находящиеся под наркозом, выздоровеют и смогут передвигаться и дотягиваться до пищи и воды.
  16. Наблюдайте за мышами на предмет признаков дистресса или инфекции после процедуры в течение следующих 24 часов. Признаки дистресса или инфекции включают постоянное кровотечение, анемию и вялость. Если какой-либо из этих признаков будет замечен после процедуры, усыпьте животное (животных) путем вдыхания CO2 или вывиха шейки матки в соответствии с протоколом обращения с животными.

2. Аспирация клеток костного мозга из бедренной кости для анализа FACS

Примечание: Процедура аспирации клеток КМ у мышей очень похожа на методы, описанные в разделе 1, и может быть изучена из некоторой предыдущей литературы 9,11,12. Ниже приведен обзор некоторых различий между протоколами инъекции КМ и аспирации.

  1. Приготовьте 500 мкл PBS + 10 мМ ЭДТА (клеточная суспензионная среда: CSM) на образец для суспензии аспирации BM.
  2. Смочите шприц 27 G объемом 0,5 мл с помощью CSM перед аспирацией BM. Наполните шприц 200-500 μL CSM и немедленно изгоните его. Повторите эту процедуру 2-3 раза.
  3. Осторожно отсасывайте БМ, вытягивая поршень из шприца, в результате чего получается 20-50 мкл мышиной БМ. Затем полностью извлеките иглу из бедренной кости и суспендируйте аспирированный образец в CSM (500 мкл в пробирке объемом 1,5 мл) для следующего этапа окрашивания. Снимите мышь с носового конуса и положите ее на чистое бумажное полотенце, чтобы предотвратить аспирацию подстилки во время восстановления. Наблюдайте за всеми мышами, чтобы убедиться в восстановлении после анестезии, прежде чем положить их обратно на стойку для мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация/забор БМ может быть повторена, но повторная процедура в тот же день должна быть выполнена на противоположной бедренной кости, чтобы предотвратить повторную травму той же ноги. Несмотря на то, что информации о частоте аспирации КМ мало, мы считаем, что аспирация бедренной кости обычно повторяется каждые 4 недели и может быть выполнена в общей сложности не менее 3-4 раз без каких-либо проблем (например, инфекции), основываясь на нашем опыте. Однако следует иметь в виду, что костный мозг на контралатеральной стороне трансплантированного костного мозга обычно имеет более низкое клеточное приживление.
  4. Пеллеты из костного мозга аспирируются за 5 минут при 300 × g, 4 °C.
  5. Аспирируйте надосадочную жидкость, добавьте 0,5-1 мл буфера для лизиса ACK (150 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 0,1 мМ ЭДТА) в каждую пробирку и сделайте вихрь для ресуспендирования клеток. Выложить на лед на 5-10 минут.
  6. Отфильтруйте каждую трубку через нейлоновую сетку в новую трубку.
  7. Промойте тюбик 1 мл буфера FACS и добавьте его через нейлоновую сетку в новую пробирку.
  8. Пеллетные ячейки путем 5-минутного вращения при 300 × г, 4 °C.
  9. Отсадите надосадочную жидкость и добавьте красящий раствор, содержащий желаемые антитела13. Выложить на лед на 20 минут.
  10. Промойте клетки и проанализируйте их в соответствии с экспериментальной установкой.
    1. Промойте клетки буфером FACS (PBS, 2% FBS, 2 мМ ЭДТА) и окрашивайте их антителами в течение 30 мин на льду в общем объеме 50 μл. Промойте и окрашивайте клетки йодидом пропидия (PI) в конечной концентрации 1 μг/мл непосредственно перед анализом или сортировкой. Выполните анализ после сортировки для проверки чистоты отсортированных популяций клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все антитела, используемые для проточной цитометрии, подробно описаны в Таблице материалов.
    2. Используйте следующие стратегии стробирования FACS (рис. 2-7) для анализа привитых клеток из костного мозга мыши.
      1. Различайте популяции клеток по их свойствам прямого (размер) и бокового рассеяния (гранулярности).
      2. Выполните дискриминацию дублетов, построив график зависимости FSC-H от FSC-W после SSC-H и SSC-W.
      3. Исключите мертвые клетки.
      4. Различайте популяции клеток по CD45 человека и CD45 мыши. Эти комбинации окрашивания антителами позволяют обнаруживать CD3, CD19 и CD33 человека, а также в составе фракции CD45 человека.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перед окрашиванием образцов не забудьте использовать мышиные и человеческие Fc-блоки, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител. Обычно мы окрашиваем блоками Fc (мышь + человек) на 10 минут на льду, а затем добавляем антитела, не промывая клетки. Обратитесь к инструкциям каждой компании о том, как использовать антитела блока Fc.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Следуя этим протоколам 1,14,15,16,17,18,19,20, каждый образец был пересажен, и была создана мышиная модель ксенотрансплантата. Цель...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мышиные модели ксенотрансплантатов важны для изучения как нормального, так и патологического кроветворения человека. КМ является источником кроветворения3; поэтому изучение гематологических заболеваний требует успешного приживления редких стволовых ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Р.М. входит в состав консультативных советов компаний Kodikaz Therapeutic Solutions, Orbital Therapeutics и 858 Therapeutics, а также является изобретателем ряда патентов, связанных с иммунотерапией рака CD47, лицензированных компанией Gilead Sciences. Р.М. является соучредителем и акционером компаний Pheast Therapeutics, MyeloGene и Orbital Therapeutics.

Благодарности

Мы благодарим всех членов лаборатории Majeti за их помощь, поддержку, ободрение и вдохновение на протяжении многих лет. Мы выражаем признательность Центру проточной цитометрии Стэнфордского института стволовых клеток, Программе Биннса по исследованию пуповинной крови и пациентам за донорство своих образцов. Для образцов человека нормальный донорский костный мозг человека и клетки периферической крови были получены в свежем виде от AllCells или Стэнфордского центра крови. Мы благодарим лабораторию Накаучи в Стэнфордском университете за безвозмездную передачу плазмиды pBac-AkaLuc-tdTomato. Прежде всего, мы хотели бы поблагодарить ветеринаров и сотрудников службы контроля животных в Центре ветеринарной службы в Стэнфорде, которые заботятся о наших мышах. В частности, Майк Альварес, руководитель центра для животных, настолько тщательно подошел к работе с мышами, что без него не будет преувеличением сказать, что без него наши исследования были бы невозможны.

Эта работа была поддержана грантами NIH 1R01HL142637 и 1R01CA251331, Стэнфордским центром исследований и медицины раковых стволовых клеток им. Людвига, а также программой грантов Blood Cancer Discoveries через Общество лейкемии и лимфомы, Фонд Марка по исследованию рака и Группу Пола Г. Аллена Frontiers. Y.N. был поддержан Фондом гуманитарных наук Накаяма и стипендией декана Медицинской школы Стэнфордского университета. А.Е. был поддержан Калифорнийским университетом в рамках премии F32CA250304, Программой повышения квалификации резидентуры в Стэнфорде и Премией ученого Американского общества гематологов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1/2 mL Syringe, 27 GBD305620https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing BufferQualoty Biological118-156-101CShttps://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biological IrradiatorKimtronIC-250https://www.kimtron.com/ic-250
ChlorhexidineNolvasanNDC 54771-8701-1https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Ethyl alcohol, proof 190Gold Shieldhttps://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetal Bovine Serum (FBS)Omega ScientificFB-01https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Flow cytometer, AriaIIBeckton Dickinson (BD)cell sorting
IMDMGibco12440053https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USPDechraNDC 17033-094-25https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA
Strain #:005557		Six- to ten-week-old male or female 
Ophthalmic ointment, USPBausch LombNDC 24208-780-55https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a
7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)VetOneNDC 13985-748-20http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4Homemade
Penicillin-StreptomycinGibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iodineBetadineNDC 67618-155-16https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (in the U.S.)Sigma-Aldrich808350-5MGAkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antibody panel (in vivo, mouse bone marrow)
AntigenDilution
Antigen: Anti-human CD45
Fluorophore: V450
Clone: HI30		BD Biosciences5603671:25
Antigen: Anti-mouse CD45.1
Fluorophore: PE-Cy7
Clone: A20		eBioscience25-0453-811:50
Antigen:Anti-mouse TER-119
Fluorophore: PE-Cy5
Clone: TER-119		eBioscience15-5921-831:100
Antigen:Anti-human CD3
Fluorophore: APC-Cy7
Clone: SK7		BD Biosciences3410901:12.5
Antigen:Anti-human CD19
Fluorophore: APC
Clone: HIB19		BD Biosciences5554151:25
Antigen:Anti-human CD33
Fluorophore: PE
Clone: WM53		BD Biosciences5554501:25
Live/Dead stainingConc.
PIInvitrogen1 μg/mL
Compensation beads
Negative controlBD BiosciencesSee instruction for details
Anti-mouse Ig, κBD BiosciencesSee instruction for details

Ссылки

  1. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  2. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature reviews. Genetics. 132, 1-14 (2020).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Méndez-Ferrer, S., et al. Bone marrow niches in haematological malignancies. Nature Reviews. Cancer. 20 (5), 285-298 (2020).
  5. Frassoni, F., et al. Direct intrabone transplant of unrelated cord-blood cells in acute leukaemia: a phase I/II study. The Lancet. Oncology. 9 (9), 831-839 (2008).
  6. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature Medicine. 9 (7), 959-963 (2003).
  7. McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
  8. Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Scientific Reports. 6 (1), 23886(2016).
  9. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. Journal of Visualized Experiments. (89), e51660(2014).
  10. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  11. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (1949).
  12. Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52 (9), 1806-1808 (2011).
  13. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  14. Chan, S. M., et al. Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations induce BCL-2 dependence in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 21 (2), 178-184 (2015).
  15. Zhang, T. Y., et al. IL-6 blockade reverses bone marrow failure induced by human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 12 (538), (2020).
  16. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLIFE. 6, 27873(2017).
  17. Nishimura, T., et al. Sufficiency for inducible Caspase-9 safety switch in human pluripotent stem cells and disease cells. Gene Therapy. 27 (10-11), 525-534 (2019).
  18. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  19. Okada, M., et al. A prospective multicenter phase II study of intrabone marrow transplantation of unwashed cord blood using reduced-intensity conditioning. European Journal of Haematology. 100 (4), 335-343 (2018).
  20. Fink, D., et al. Capacity of the medullary cavity of tibia and femur for intra-bone marrow transplantation in mice. PloS One. 14 (11), 0224576(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены