Оценка микроархитектуры трабекулярной кости на мышиной модели остеопороза

Резюме

Данный протокол представляет собой экономичный и эффективный метод количественной оценки микроархитектуры костной ткани на мышиной модели остеопороза путем сочетания методов окрашивания гематоксилин-эозином (ГЭ) и микрокомпьютерной томографии (Микро-КТ).

Аннотация

Микроструктура кости относится к расположению и качеству костной ткани на микроскопическом уровне. Понимание костной микроструктуры скелета имеет решающее значение для понимания патофизиологии остеопороза и улучшения его лечения. Однако работа с образцами костей может быть сложной задачей из-за их твердых и плотных свойств. Во-вторых, специализированное программное обеспечение затрудняет обработку и анализ изображений. В этом протоколе мы представляем экономичное и простое в использовании решение для анализа микроструктуры трабекулярной кости. Подробно описаны шаги и меры предосторожности. Микро-КТ — это метод неразрушающей трехмерной (3D) визуализации, который позволяет получать изображения структуры трабекулярной кости с высоким разрешением. Он позволяет объективно и количественно оценить качество костной ткани, поэтому он считается золотым стандартом оценки качества костной ткани. Тем не менее, гистоморфометрия остается незаменимой, поскольку она предлагает важнейшие параметры на клеточном уровне, преодолевая разрыв между двумерной (2D) и 3D-оценкой образцов костей. Что касается гистологических методов, мы выбрали декальцинацию костной ткани, а затем традиционное введение парафина. Таким образом, сочетание этих двух методов может дать более полную и точную информацию о микроструктуре кости.

Введение

Остеопороз является распространенным метаболическим заболеванием костей, особенно среди пожилых людей, и связан с повышенным риском хрупких переломов. По мере того, как остеопороз становится все более распространенным^{в Китае1}, будет расти спрос на изучение костных структур мелких животных ^2,3. Предыдущие методы измерения потери костной массы основываются на результатах двумерной двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии. Однако при этом не учитываются изменения в архитектурной микроструктуре трабекулярной кости, которая является ключевым^{фактором для} прочности скелета. Микроструктура кости влияет на ее прочность, жесткость и устойчивость к изломам. Сравнивая микроархитектуру костной ткани в норме и при патологии, можно выявить изменения морфологии, структуры и функции костной ткани, вызванные остеопорозом. Эта информация способствует пониманию развития остеопороза и его связи с другими заболеваниями.

Микрокомпьютерная томография (Микро-КТ) в последнее время стала популярным методом оценки морфологии кости, где она может предоставить точные и исчерпывающие данные о структуре и параметрах плотности кости, таких как объемная доля кости, толщина и разделение ^5,6. В то же время на результаты микро-КТ может влиять аналитическое программное обеспечение⁷. Различные методы получения, оценки и составления отчетов изображений используются различными коммерческими системами микро-КТ. Это несоответствие затрудняет сравнение и интерпретацию результатов, полученных в различных исследованиях⁵. Кроме того, в настоящее время она не может заменить костную гистоморфометрию в предоставлении исследователям информации о параметрах на клеточном уровне в костной системе⁸. Между тем, гистологические методы позволяют непосредственно наблюдать и измерять микроскопическую морфологию кости. Окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ) является распространенным методом окрашивания, используемым в гистологии для визуализации общей структуры клеток и тканей. Применяется для выявления наличия костной ткани и ее микроархитектуры.

В данной статье используется микро-КТ в сочетании с техникой среза тканей (окрашивание гематоксилин-эозином [HE]) для сбора изображений костной ткани и проведения количественного анализа трабекулярной кости для оценки изменений микроструктуры кости в мышиной модели остеопороза.

протокол

Протокол для животных был одобрен Комитетом по этике животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (рекордный номер: 2020-34). Самки мышей C57BL/6J (12 недель, n = 14) были случайным образом разделены на две группы: симуляционную (группа Sham, n = 7) и модельную группу (группа OVX, n = 7). Животные были приобретены у коммерческого поставщика (см. Таблицу материалов). Все мыши содержались в индивидуальных клетках при температуре 22-26 °C при влажности 45%-55%, им давали адаптироваться к новой среде в течение 1 недели, обеспечивали свободный доступ к воде и рациону. Все экспериментальные исследования на животных проводились в Чэндуском университете традиционной китайской медицины, и все усилия были направлены на то, чтобы свести к минимуму страдания животных.

1. Подготовка модели животного

1. Обезболивают 12-недельную мышь внутрибрюшинной инъекцией 1,25% Авертина (трибромэтанол в трет-амиловом спирте, см. таблицу материалов) в дозировке 0,02 мл/г. Положите мышь лежа на стерильный хирургический операционный стол и обездвижьте ее конечности, надежно заклеив их скотчем.
2. Используйте ножницы (см. Таблицу материалов), чтобы подстричь волосы, которые могут повлиять на хирургическую операцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется избегать повреждения кожи во время подготовки места операции.
3. Тщательно вымойте руки и наденьте хирургические перчатки. Продезинфицируйте спину мыши три раза повидон-йодом (см. Таблицу материалов) и используйте медицинскую марлю (см. Таблицу материалов), чтобы высушить ее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны; Слишком влажные волосы во время дезинфекции могут привести к послеоперационному переохлаждению у мышей.
4. Сделайте скальпелем надрез длиной примерно 0,5-1,0 см, расположенный на расстоянии 1 см от одной трети средней линии спины мыши (см. Таблицу материалов). Аккуратно отделите фасцию и разрежьте мышцу тканевыми ножницами (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока яичник не станет виден. Перевязать окружающие кровеносные сосуды нерассасывающимися швами (см. Таблицу материалов) и удалить яичник.
5. Промойте полость 0,9% физиологическим раствором, затем наложите швы на кожу, мышцу и фасцию отдельно (см. таблицу материалов).
6. Повторите ту же последовательность шагов с другой стороны.
7. Удалите периовариальный жир того же размера, что и яичник, и выполните ту же хирургическую процедуру, упомянутую выше, для остальных шагов по созданию фиктивной модели.
8. Восстановительный период составляет 1 неделю после операции. Через 8 недель модели мышей с остеопорозом будут успешно установлены ^9,10.

2. Микрокомпьютерная томография

1. Усыпьте мышь путем вдыхания избытка_СО2 . Удалите как можно больше мягких тканей из бедренной кости мыши после эвтаназии и получите свежий образец для сканирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что идеального решения для сохранения образцов не существует, можно предпринять определенные шаги, чтобы максимизировать качество результатов микро-КТ. Перед фиксацией позаботьтесь о том, чтобы удалить как можно больше окружающих тканей. Формалин или буферный формалин является наиболее предпочтительным методом фиксации с хранением в PBS^11,12.
2. Дважды щелкните значок программного обеспечения системы микро-КТ на рабочем столе, чтобы запустить систему (см. Таблицу материалов). Выберите слой образца, совместимый с полем зрения образца (FOV) 18 мм x 18 мм. Загрузите соответствующий слой образца в машину и закройте люк.
3. Нажмите кнопку «Прогрев » на панели управления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Потребовалось короткое время прогрева. Не пытайтесь открыть люк во время рентгеновского излучения. Проверьте индикатор X-Ray On на передней панели и мониторе компьютера, чтобы убедиться, генерируются ли рентгеновские лучи.
4. Нажмите кнопку Меню , чтобы установить новую базу данных, затем создайте новую выборку и исследование.
5. Выберите «Вручную» в раскрывающемся списке «Меню» и введите пользовательские значения напряжения и тока на панели управления. Установите напряжение (кВ) на 90, ток (мкА) на 80, режим сканирования на высокое разрешение, 14 мин и угол обзора (мм) на 18 мм x 18 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству по эксплуатации различных систем микрокомпьютерной томографии, чтобы установить соответствующие параметры.
6. Надежно расположите кость с помощью полиэтиленовой пленки в слое образца. Закройте люк. Убедитесь, что объект находится точно по центру в окне X-захвата, нажимая кнопки регулировки на аппарате.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка образца должна быть медленной и аккуратной, чтобы избежать его случайного попадания в машину.
7. Нажмите кнопку «Пуск », чтобы начать компьютерную томографию.

3. Анализ данных КТ

1. Войдите в программное обеспечение (см. Таблицу материалов) и выберите данные для анализа. Нажмите «Сабвуфер » и установите Размер пикселя на 10 мкм. Переместите и измените размер области интереса (ROI), включив в нее дистальный отдел бедренной кости над пластиной роста. Нажмите кнопку Start (см. рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пикселя субобъемной реконструкции был выбран равным 10 мкм, поскольку толщина трабекул изображений была оценена примерно в 20-30 мкм на основе гистологических данных предыдущих исследований¹³. Если отношение сигнал/шум недостаточно для обработки данных, необходимо выполнить сканирование с высоким разрешением в течение 1 часа.
2. Нажмите кнопку Анализ 3D, чтобы получить результирующую 3D-реконструкцию.
3. Экспортируйте данные из системы микро-КТ на компьютер для анализа.
4. Импортируйте восстановленные данные КТ. Нажмите «Обработать > калькуляторе изображений», затем нажмите «Контактная площадка области» > интерактивной. Установите желтый флажок на соответствующую рентабельность инвестиций.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Область интереса (ROI) начинается примерно на 540 мкм проксимальнее ростовой пластинки и простирается на 1600 мкм проксимальнее для оценки фактического метаболизма и ремоделирования костной ткани.
5. Выберите дополнение Bone Microarchitecture Analysis (BMA) (см. Таблицу материалов). Щелкните Сегментировать кортику , а затем Сегментировать трабекулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трабекулярная и кортикальная кости выбираются автоматически. Как правило, ручная регулировка не требуется.
6. Нажмите Save Final Object Map , а затем нажмите Measure Bone для вычисления костных морфометрических индексов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь была рассчитана только относительная минеральная плотность костной ткани (МПК), так как контроль не был добавлен.

4. Декальцинация костной ткани

1. Зафиксируйте образцы костей в 4%-ном параформальдегиде (см. таблицу материалов) в течение 24 ч. Промойте образцы трижды PBS (см. Таблицу материалов) каждый раз в течение 20 минут.
2. Трижды промойте салфетку дистиллированной водой в течение 20 минут каждый раз. Перенесите ткань в раствор для декальцинации, содержащий ЭДТА (см. таблицу материалов), и декальцинируйте в течение 30 дней с еженедельной сменой раствора до конечной точки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прокалывание иглой, защемление рук и зажим используются для прекращения декальцинации, когда костная ткань становится мягкой или отсутствует ощущение сопротивления при иглоукалывании. Физический метод обнаружения может привести к некоторому повреждению структуры ткани, поэтому старайтесь избегать чрезмерных усилий или повторного тестирования.
3. Выньте ткань из фиксатора и скальпелем обрежьте ткань в вытяжном шкафу. Положите обрезанную салфетку и соответствующую этикетку в коробку для обезвоживания.
4. Поместите ящик для обезвоживания в корзину и обезвоживайте его в тканевой комбайне (см. Таблицу материалов) градиентным спиртом (75% этанол в течение 4 ч, 85% этанол в течение 2 ч, 90% этанол в течение 2 ч, 95% этанол в течение 1 ч, безводный этанол в течение 30 мин, безводный этанол II в течение 30 мин, ксилол I в течение 5-10 мин, ксилол II в течение 5-10 мин, воск I в течение 1 ч, воск II в течение 1 ч, воск III в течение 1 ч).
5. Используйте машину для заделки (см. Таблицу материалов), чтобы заложить пропитанную воском ткань. Вылейте расплавленный воск в коробку для закладки и поместите ткань из коробки для обезвоживания до того, как воск затвердеет.
6. Сориентируйте ткань в соответствии с поверхностью закладки и прикрепите соответствующую этикетку. Охладить на морозильном столе при температуре -20 °C (см. Таблицу материалов). После затвердевания извлеките восковой блок из коробки для закладки и при необходимости обрежьте восковой блок (см. Таблицу материалов).
7. Разрежьте обрезанный восковой блок на предметные стекла толщиной 3 мкм на микротоме (см. Таблицу материалов). Поместите предметные стекла в теплую воду с температурой 40 °C на машине для разбрасывания салфеток (см. Таблицу материалов), чтобы расплющить ткань и зачерпнуть их предметным стеклом.
8. Выпекать в духовке при температуре 60 °C (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока вода не испарится и воск не растает. Выньте и храните при комнатной температуре (RT) для последующего использования.

5. Окрашивание HE

1. Поместите предметные стекла в ксилол I на 20 мин, затем в ксилол II на 20 мин. Далее поместите предметные стекла в безводный этанол I и безводный этанол II на 5 мин каждый, 75% спирт на 5 мин, а затем промойте предметные стекла водопроводной водой (см. таблицу материалов).
2. Инкубируют в гематоксилине (см. таблицу материалов) в течение 3-5 мин. Дифференцируют образцы раствором соляной кислоты (см. таблицу материалов). Обработайте предметные стекла раствором аммиака (см. Таблицу материалов) для воронения, а затем промойте предметные стекла водой.
3. Поместите предметные стекла в 85%, 95% градиентный спирт для обезвоживания и окрасьте раствором эозина (см. таблицу материалов) в течение 5 минут.
4. Поместите предметные стекла в безводный этанол I на 5 мин, безводный этанол II на 5 мин и безводный этанол III на 5 мин. Обработайте предметные стекла ксилолом I в течение 5 минут, ксилолом II в течение 5 мин и закрепите нейтральным бальзамом (см. таблицу материалов).
5. Рассмотрите каждое предметное стекло под микроскопом. Затем выберите репрезентативные срезы для панорамного сканирования (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется не менее трех последовательных срезов. Перед панорамным сканированием срезы необходимо рассмотреть под микроскопом, чтобы убедиться в их полноте и четкости. Убедитесь, что полость костного мозга, кортикальная кость и губчатая кость полностью отображены, а также что видны различные типы костных клеток.

6. Анализ ОФ изображений

1. Открывайте HE-изображения с помощью программы CaseViewer (см. Таблицу материалов). Выберите интересующую область (ROI) на слайде и сохраните ее в виде цветного изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор ROI согласуется с вышеупомянутым программным обеспечением.
2. Откройте изображение в ImageJ (см. Таблицу материалов). Выберите инструмент « Палочка » на панели инструментов. Нажмите на трабекулярную кость.
3. При необходимости отрегулируйте допуск и смежные параметры. Перейдите в раздел «Коррекция изображения >» > «Черно-белый » и нажмите кнопку «ОК». Повторите эти действия для других участков кости.
4. Инвертируйте выделение и залейте его белым цветом. Сохраните изображение в виде маски для анализа (см. рис. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную методологию см. в ранее опубликованной работе¹⁴.
5. Откройте маску в аналитическом программном обеспечении^15,16 (см. Таблицу материалов). Запустите Process > Binary > Make Binary, чтобы преобразовать цветное изображение в двоичное.
6. Используйте плагин 17 (см. Таблицу материалов) в программном обеспечении для анализа структурных параметров: Run Area/Volume Fraction для вычисления объема кости к общему объему кости (BV/TV [%])^18,19.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим для костных трабекул и костного мозга, заполняя весь ROI на изображениях HE.

Результаты

Микро-КТ анализ
Мы измерили трабекулярные микроархитектурные параметры у мышей из обеих групп и сообщили их средние значения и SD в таблице 1. Распределение некоторых параметров (т.е. отношение объема кости к общему объему ткани, трабекулярная толщи?...

Обсуждение

Остеопороз может приводить к частым переломам, которые являются дорогостоящими, могут вызывать боль, инвалидность или даже смерть и серьезно влиять на качество жизни пациентов²⁰. На протяжении многих лет модель овариоэктомии была признана одним из стандартных методов изу?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Adobe Photoshop	Adobe Inc.
Ammonia Solution	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2021070101
Analyze 12.0	AnalyzeDirect, Inc
Anatomical Forceps	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J3C030
Anhydrous Ethanol	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022070501
Automatic Dyeing Machine	Thermo scientific	Varistain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-on	AnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J mice	SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier Slides	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd	220518001
Coverslips	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.	220518001
Decalcification Solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	CR2203047
Delicate Scissors	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	ZJA010
Embedding box marking machine	Thermo scientific	PrintMate AS
Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Fiji: ImageJ	National Institutes of Health, USA
Film Sealer	Thermo scientific	Autostainer 360
Freezing Table	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
H&E Staining Kit	Leagene	DH0020
Hydrochloric Acid Solution	Sichuan Xilong Science Co., Ltd	210608
ImageJ2 Plugin		BoneJ 7.0.16
Medical Gauze	Shandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures	Ethicon, Inc.	SA84G
Needle Holder	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J32010
Neutral Balsam	Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners	3DHISTECH Ltd.	PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS buffer	Biosharp	G4202
Povidone-iodine solution 5%	Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer, Inc.
Rotary Microtome	Thermo scientific	HM325
Scalpel	Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd	20170022
Scan & Browse Software	3DHISTECH Ltd.	CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves	Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd	22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single Use	Shandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture Needles	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	PW8068
Tissue Processor	Thermo scientific	STP420 ES
Tissue Spreading and Baking Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JK-6
Tribromoethanol	Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd	M2920
Wax Trimmer	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JXL-818
Xylene	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022051901