JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой рукописи описывается подробный видеопротокол культивирования первичных эпителиальных клеток хрусталика (LEC), направленный на улучшение воспроизводимости и помощь в исследованиях катаракты и помутнения задней капсулы (ПКЯ). Он предлагает пошаговые инструкции по препарированию хрусталика, изоляции и валидации LEC, что служит ценным руководством, особенно для новичков в этой области.

Аннотация

Эпителиальные клетки хрусталика (LEC) играют несколько важных ролей в поддержании гомеостаза и нормального функционирования хрусталика. LEC определяют рост, развитие, размер и прозрачность хрусталика. И наоборот, дисфункциональные ЛЭК могут привести к образованию катаракты и помутнению задней капсулы (ПКЯ). Следовательно, создание надежной системы первичного культивирования LEC важно для исследователей, занимающихся разработкой хрусталиков, биохимией, терапией катаракты и профилактикой ПКЯ. Тем не менее, культивирование первичных ЛЭК уже давно представляет собой проблему из-за их ограниченной доступности, медленной скорости распространения и деликатного характера.

Данное исследование направлено на устранение этих препятствий путем представления комплексного протокола для первичной культуры LEC. Протокол включает в себя такие важные этапы, как разработка оптимизированной питательной среды, точная изоляция капсул хрусталика, методы трипсинизации, процедуры субкультуры, протоколы сбора урожая и рекомендации по хранению и транспортировке. На протяжении всего процесса культивирования морфологию клеток контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Для подтверждения подлинности культивируемых ЛЭК были проведены иммунофлуоресцентные анализы для выявления наличия и субклеточного распределения критических белков хрусталика, а именно αA- и γ-кристаллинов. Этот подробный протокол предоставляет исследователям ценный ресурс для культивирования и характеристики первичных ЛЭК, что позволяет продвинуться в понимании биологии хрусталика и разработке терапевтических стратегий для расстройств, связанных с хрусталиком.

Введение

Хрусталик глаза играет решающую роль в зрении, фокусируя входящий свет на сетчатке. Он состоит из прозрачной аваскулярной структуры, состоящей из специализированных клеток, среди которых ключевыми игроками являются эпителиальные клетки хрусталика (LEC). ЛЭК располагаются на передней поверхности хрусталика и отвечают за поддержание его прозрачности, регулирование водного баланса и участие в росте и развитии хрусталика 1,2. LEC — это уникальный тип клеток, расположенных в передней части хрусталика, играющих важнейшую роль в поддержании четкости и функции хрусталика путем непрерывного производства волокон хрусталика на протяжении всей жизни.

Катаракта характеризуется прогрессирующим помутнением хрусталика, что приводит к искажению и рассеянию света, что приводит к ухудшению зрения 3,4. Точные механизмы, лежащие в основе образования катаракты, сложны и многофакторны, включая различные клеточные и молекулярные процессы, такие как ультрафиолетовое излучение, окислительное повреждение и гликирование 5,6. Было обнаружено, что LEC вносят значительный вклад в развитие катаракты, что делает их жизненно важным объектом исследований 1,2,7,8,9.

Кроме того, одной из наиболее актуальных проблем в офтальмологии на сегодняшний день является относительно высокая частота помутнения задней капсулы (СПКЯ), также известной как вторичная катаракта. ПКЯ остается наиболее распространенным осложнением после операции по удалению катаракты, поражая до 20-40% взрослых пациентов и 100% детей в течение 5 лет после операции10. ПКЯ в первую очередь вызывается остаточными ЛЭК, которые остаются в капсульном мешке после экстракции катаракты. Эти клетки претерпевают многогранную патофизиологическую трансформацию, включающую не только эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), но и дифференцировку ЛЭК в волокна хрусталика, в результате чего образуется клеточная популяция, представляющая собой смесь ЛЭК, волокон и миофибробластов 11,12,13. Трансформированные клетки пролиферируют и мигрируют через заднюю капсулу хрусталика, что приводит к ухудшению зрения. Понимание поведения и механизмов контроля LEC в культуральных моделях может дать ценную информацию о профилактике и лечении ПКЯ. Таким образом, этот протокол культивирования LEC представляет собой жизненно важный инструмент для офтальмологических исследователей, стремящихся изучить, понять и, в конечном счете, бороться с этим распространенным послеоперационным осложнением.

Чтобы разобраться в хитросплетениях биологии LEC и ее роли в формировании катаракты и ПКЯ, необходимо создать надежные и воспроизводимые системы первичных клеточных культур in vitro . Первичная культура LEC предоставляет исследователям контролируемую среду для изучения функций, сигнализации и молекулярных характеристик LEC. Кроме того, он позволяет исследовать клеточные процессы и эффекты различных экспериментальных условий, предоставляя ценную информацию о физиологии и патологии хрусталика.

Предыдущие исследования обогатили наше понимание методов культивирования LEC 14,15,16,17,18,19,20. Несмотря на то, что в этих исследованиях использовались различные методологии и были получены важные результаты о поведении и характеристиках LEC, в современной литературе отсутствует всеобъемлющий и доступный протокол видеозаписи для культивирования LEC. Это ограничение может препятствовать способности начинающих исследователей точно воспроизводить методы и может привести к несоответствиям и вариациям в экспериментальных результатах. Предоставляя протокол видеозаписи, данная исследовательская работа направлена на то, чтобы восполнить этот пробел и предоставить стандартизированный ресурс, который может повысить воспроизводимость и облегчить передачу знаний в области культуры LEC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Процедурное одобрение было предоставлено Комитетом по уходу за животными и использованию Научного центра здоровья Университета Северного Техаса (номер протокола: IACUC-2022-0008). В этих исследованиях использовали молодых мышей C57BL/6J, как правило, в возрасте до 2 недель.

1. Подготовка питательной среды и диссекция хрусталика

  1. Приготовьте питательную среду, добавив 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,1 мл гентамицина 50 мг/мл к 450 мл DMEM.
  2. Гуманная эвтаназия мышей C57BL/6J младше 2 недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы усыпляли методом ингаляцииСО2 . Оптимальная скорость потока для систем эвтаназииCO2 должна смещать от 30% до 70% объема камеры или клетки/мин.
  3. Аккуратно удалите веки хирургическими ножницами и слегка надавите изогнутым пинцетом на противоположные стороны глазницы, в результате чего глаз выпячивается наружу. Сделайте аккуратный надрез на роговице с помощью катарактального ножа и осторожно извлеките хрусталик изогнутым пинцетом, следя за тем, чтобы не повредить хрусталик или его капсулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность при выполнении этих действий, чтобы сохранить целостность капсулы хрусталика. Из-за деликатного характера линзы важно использовать препарирующие инструменты с изогнутыми и тупыми концами, чтобы свести к минимуму риск повреждения линзы.
  4. Используйте изогнутый пинцет с тупыми кончиками для переноса линз в 60-миллиметровую пластиковую чашку для культивирования тканей, наполненную 5 мл предварительно подогретого и стерильного раствора фосфатного буфера (DPBS) Dulbecco, содержащего 10 мкг/мл гентамицина.
  5. Осторожно промойте линзы раствором DPBS, содержащим 10 мкг/мл гентамицина, чтобы удалить любой потенциальный мусор или загрязнения, подготовить линзы к дальнейшей обработке и поддерживать стерильную культуральную среду.
  6. Чтобы получить достаточное количество LEC, объедините четыре линзы для 24-луночного культурального планшета и шесть линз для 6-луночного культурального планшета.

2. Изоляция LEC

  1. После завершения процесса промывки поместите линзу на лист фильтровальной бумаги, дав ей высохнуть.
  2. После того, как хрусталик достаточно высохнет, осторожно перенесите его на крышку чашки Петри, чтобы подготовиться к извлечению капсулы хрусталика.
  3. Поверните линзу вверх, убедившись, что передний сегмент направлен вверх. Используя пинцет для удержания передней капсулы, используйте щипцы капсулогексиса в доминирующей руке, чтобы создать небольшой разрыв в капсуле. Осторожно потяните два инструмента в противоположных направлениях, чтобы снять капсулу, и поместите ее в DPBS до тех пор, пока не будут завершены все вскрытия линз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать каких-либо расхождений, исследователи должны оперативно препарировать каждую эпителиальную капсулу хрусталика и временно хранить их в DPBS. Только после завершения всех вскрытий капсулы коллективно переводятся на трипсин, поддерживаемый при 37 °C, что обеспечивает синхронизированное и равномерное воздействие.
  4. Осторожно перенесите капсулу объектива на 6-луночную пластину. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсина в каждую лунку, чтобы инициировать процесс ферментативного сбраживания.
  5. Осторожно перемешайте раствор трипсина, чтобы обеспечить равномерное проникновение. Поместите планшет в инкубатор для клеточных культур и дайте капсуле перевариться в течение 8-10 минут при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап способствует разрушению ткани капсулы хрусталика и последующему высвобождению отдельных эпителиальных клеток.
  6. После инкубации тщательно измельчите переваренную капсулу хрусталика с помощью ножниц для препарирования, чтобы разрушить оставшиеся скопления тканей и способствовать отделению клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание уделяется тщательности измельчения тканей, чтобы обеспечить эффективное высвобождение клеток из переваренных капсул хрусталика.
  7. Добавьте 0,5 мл питательной среды, содержащей 10% FBS, для гашения трипсина. Переложите образцы тканей в центрифугируемую пробирку и центрифугу при 1000 × г в течение 5 мин.
  8. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не повредив гранулу клетки. Используйте 1 мл питательной среды для ресуспендирования клеток и посева клеток в 24-луночный планшет.
  9. Меняйте питательную среду каждые 2-3 дня.

3. Субкультура LECs

  1. Как только клетки достигнут слияния, извлеките среду из чашки для культивирования. Промойте клетки 2 раза 1 мл DPBS.
  2. Добавьте 200 мкл раствора трипсина-ЭДТА и поместите клетки в инкубатор на 5 минут.
  3. После инкубации извлеките клетки из инкубатора и осмотрите их под микроскопом, чтобы убедиться, что они отделились от чашки для культивирования и начали плавать.
  4. Добавьте 1 мл питательной среды и осторожно пропипетируйте клетки 3-5 раз, чтобы отделить все клетки.
  5. Переложите клетки в центрифужные пробирки и центрифугу при 1 000 × г в течение 5 мин.
  6. Осторожно удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в полной питательной среде.
  7. При необходимости подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
  8. Разделите клеточную суспензию в соотношении 1:2 или 1:3 для целей субкультивирования.
  9. Когда культура снова станет сливающейся, повторите вышеупомянутые процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: LEC процветают в условиях высокой плотности культивирования. Избегайте чрезмерного разбавления клеток, так как это может препятствовать их росту.

4. Хранение и отгрузка

ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное количество ячеек для хранения ~1 × 106.

  1. Тщательно промойте клетки 3 раза 1 мл DPBS. После промывки добавляют 1 мл раствора трипсина-ЭДТА и помещают клетки в инкубатор на 5 мин.
  2. Добавьте 2 мл полной питательной среды и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и центрифугу при 1000 × г в течение 5 мин.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в замораживающей среде, состоящей из 90% FBS и 10% DMSO, стремясь к плотности клеток 1 × 106 клеток/мл. Переведите клеточную суспензию в криовиальную.
  4. Немедленно переместите ячейки в среду с температурой -20 °C на 1 час, а затем -80 °C на ночь, а затем на постоянное хранение в жидком азоте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкий азот недоступен, ячейки можно хранить при температуре -80 °C после первого часа при -20 °C.
  5. Если требуется отгрузка, отправьте клетки в криовиальной камере в упаковке с сухим льдом для доставки в течение ночи.
  6. После получения клеток обеспечьте быстрое восстановление и поместите клетки в субкультуру. Если немедленное культивирование невозможно, пересадите клетки в жидкий азот для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ячейки должны быть отправлены, убедитесь, что образцы глубоко погружены в сухой лед, чтобы предотвратить возможное повреждение от колебаний температуры.

5. Валидация LEC

  1. Распределите LEC в 35-миллиметровые чашки для культур с помощью защитных стекол и культивируйте их в течение примерно 48 ч.
  2. Промойте ячейки 2 раза PBS и зафиксируйте ячейки холодным метанолом в течение 10 мин при -20 °C.
  3. Промывают фиксированные клетки в течение 3 х 5 мин PBS и инкубируют фиксированные клетки с блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре для предотвращения неспецифического связывания.
  4. После блокирования клетки инкубируют в течение ночи при 4 °C с первичными антителами (αA-кристаллин, γ-кристаллин и антитела PROX1), индивидуально разбавленными в соотношении 1:50 в буфере разбавителя.
  5. Промывают клетки в течение 3 х 5 мин PBS и инкубируют клетки со вторичными антителами, разведенными 1:100 в буфере разбавителя в течение 1 ч.
  6. Промойте клетки в течение 3 x 5 минут PBS и окрасьте клетки 5 мкг/мл Hoechst 33342 в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре для визуализации ядер.
  7. Промывают клетки в течение 2 x 5 мин PBS, чтобы удалить излишки красящего раствора и получить флуоресцентные изображения клеток с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием канала DAPI для ядер и канала FITC для αA-, γ-кристаллинов и PROX1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Как показано на рисунке 2, следуя этому протоколу, первичные ЛЭК мышей C57BL/6J прилипали к чашкам в течение 4 ч. Примечательно, что были видны остатки других тканей, таких как срезы задней капсулы и клетки волокон хрусталика. Однако эти непредусмотренные элементы не прикрепл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол, представленный в этом документе, представляет собой всеобъемлющее, пошаговое руководство по успешной изоляции, культуре и субкультуре первичных LEC, дополненное сопроводительной видеодокументацией. Подробное визуальное руководство вместе с письменными инструкциями повыша?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана NEI R21EY033941 (Hongli Wu); Министерство обороны W81XWH2010896 (Хунли Ву); R15GM123463-02 (Кайле Грин и Хунли Ву)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody Jackson ImmunoResearch#715-545-150For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003For cell validation
Antibody dilution bufferLicor#927-60001For cell validation
Beaver safety knifeBeaver-Visitec International#3782235For lens dissection
Blocking bufferLicor#927-60001For cell validation
Capsulorhexis forcepsTitan Medical InstrumentsTMF-124For lens capsule isolation
DMEMSigma AldrichD6429For LECs culture medium
DMSOSigma Aldrich#D2650For making freezing medium 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher#J67802For lens dissection
Dumont tweezersRoboz Surgical InstrumentRS-4976For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)ScienCell4182For LECs culture medium
FBSSigma AldrichF2442For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)Sigma-AldrichG1397For LECs culture medium
Hoechst 33342 solutionThermo Fisher#62249For cell validation
Micro-dissecting scissorsRoboz Surgical Instrument RS-5983For lens dissection
Micro-dissecting tweezersRoboz Surgical Instrument RS5137 For lens dissection
PROX1 antibodyThermo Fisher11067-2-APFor cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissorsRoboz Surgical InstrumentRS-5608For lens capsule isolation
αA-crystallin antibodySanta Cruzsc-28306For cell validation 
γ-crystallin antibodySanta Cruzsc-365256For cell validation

Ссылки

  1. Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
  2. Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
  3. Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
  4. Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
  5. Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
  6. Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
  7. Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
  8. Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973(2022).
  9. Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
  10. Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343(2022).
  11. Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847(2021).
  12. Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
  13. Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001(2022).
  14. Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
  15. Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
  16. Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
  17. Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
  18. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).
  19. Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
  20. Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659(2014).
  21. Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
  22. Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
  23. Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
  24. Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
  25. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  26. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591(2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE208

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены