JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы представляем протокол индуцирования гипертензии Н-типа и оцениваем антигипертензивные эффекты отвара Хуотань Цзеду Тонлуо (HTJDTLD), вводимого внутрижелудочно. У крыс с гипертензией H-типа HTJDTLD обладал эффективными антигипертензивными эффектами, возможно, связанными с ингибированием стресс-индуцированной активации пути апоптоза эндоплазматического ретикулума (ER).

Аннотация

Гипертензия Н-типа, которая является специфической формой гипертензии, характеризующейся повышенным уровнем гомоцистеина (Hcy) в плазме крови, стала серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. В этом исследовании изучались гипотензивные эффекты и основные механизмы отвара Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD), высокоэффективной формулы традиционной китайской медицины, обычно используемой для лечения стеноза сосудов. Метионин использовали для индукции гипертензии H-типа у крыс, а HTJDTLD вводили внутрижелудочно. Затем систолическое и диастолическое артериальное давление каудальной артерии крыс измеряли с помощью неинвазивной каудальной манометрии крыс. Гистологическую оценку состояния аорты проводили методом окрашивания гематоксилин-эозином (ПЭ). Для измерения уровня Hcy использовали иммуноферментный анализ (ИФА), а для определения уровней мРНК и вестерн-блоттинга использовали количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой и вестерн-блоттинг для определения уровней мРНК и белка регуляторного белка глюкозы 78 (GRP78), фактора некроза опухоли (TNF), рецептор-ассоциированного фактора 2 (TRAF2), N-концевых киназ c-Jun (JNK) и каспазы-3. Результаты показали, что HTJDTLD значительно снижает артериальное давление, уменьшает гистопатологические поражения и снижает уровень Hcy после лечения метионином. Кроме того, HTJDTLD значительно ингибирует экспрессию генов и белков GRP78, JNK, TRAF2 и каспазы 3, которые участвуют в основном в пути стресс-индуцированного апоптоза эндоплазматического ретикулума (ER). В целом, результаты показали, что HTJDTLD обладает эффективными антигипертензивными эффектами у крыс с гипертензией H-типа и выявили антигипертензивные механизмы, связанные с ингибированием активации пути апоптоза, индуцированного стрессом ER.

Введение

Гипертония, являющаяся основным фактором риска инфаркта, инсульта и почечной недостаточности, стала серьезной проблемой общественного здравоохранения, затрагивающей 1 миллиард человек во всеммире1. Гомоцистеин (Hcy), аминокислота, содержащая тиоловую группу, является жизненно важным метаболическим посредником метаболизма метионина. Гипертензия с повышенным уровнем Hcy в плазме определяется как гипертензия H-типа, которая может быть значимым фактором риска возникновения и рецидива сердечно-цереброваскулярных заболеваний, таких как инсульт 2,3. Недавние исследования показали, что совместное проживание при гипертензии Н-типа может усугубить побочные эффекты сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний4. Примечательно, что 75% пациентов в Китае с гипертензией H-типа имеют первичную гипертензию, которая серьезно влияет на качество жизни5. В настоящее время лечение гипертонии Н-типа в основном включает в себя западную медицину. Тем не менее, он может вызывать определенные побочные эффекты и плохую комплаентность и больше не может удовлетворить потребности в комплексном лечении гипертензии H-типа.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) является уникальным ресурсом с более чем 2000-летней историей в Китае. В связи с неудовлетворенной потребностью в контроле гипертонии в западной медицине, клиницисты начали рассматривать потенциальную роль ТКМ в профилактике и лечении гипертонии Н-типа. Отвар Хуотань Цзеду Тонлуо (HTJDTLD) — это формула традиционной китайской медицины, разработанная профессором Юэ Дэном на основе его обширного клинического опыта7. За более чем 20 лет клинического применения HTJDTLD продемонстрировал замечательную эффективность в лечении сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний1. Тем не менее, о том, оказывает ли HTJDTLD терапевтические эффекты при гипертензии H-типа, не сообщалось. Поэтому мы поставили перед собой цель изучить антигипертензивные эффекты и специфические механизмы HTJDTLD у крыс с гипертензией H-типа, а также определить потенциальные терапевтические препараты для лечения гипертензии H-типа.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Чанчуньского университета китайской медицины. Материалы приведены в Таблице материалов.

1. Животные и лечение

  1. Случайным образом разделите в общей сложности 50 взрослых спонтанно гипертензивных крыс (SHR) (самцы в возрасте 50 дней) на пять групп, включая контрольную группу (CON), метионин (MET), группы MET + HTJDTLD + эналаприл малеат (EM), группы MET + EM и MET + HTJDTLD.
    Подопытные крысы содержались в контролируемой среде, предназначенной для обеспечения их комфорта и благополучия. В помещениях с регулируемой температурой установили постоянную температуру 22 °C и относительную влажность 40-60%. Клетки для содержания были изготовлены из прозрачного поликарбоната, что обеспечивало достаточно места для свободного передвижения каждой крысы. График освещения следовал 12-часовому циклу света/темноты, имитируя естественные условия дневного света. Крысы были обеспечены достаточным количеством пищи и воды.
  2. Обеспечьте крысам следующий рацион в течение 28 дней.
    1. Давайте крысам в группе MET 3% метиониновую диету в течение 28 дней, чтобы вызвать гипертензию H-типа.
    2. Крысам в группе MET + HTJDTLD + EM вводят внутрижелудочно с HTJDTLD (1,633 г/мл) и EM (0,2 мг/мл) в дозе 1 мл/кг при приеме крыс в дополнение к 3% метионину.
    3. Вводите крысам в группах MET + EM и MET + HTJDTLD с HTJDTLD или EM через зонд, соответственно, помимо 3% метиониновой диеты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HTJDTLD состоит из Fructus trichosanthis (20 г), Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 г), Lonicerae japonicae flos (30 г), Radix et Rhizoma nardostachyos (15 г), Radix Angelicae sinensis (15 г), Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 г), Hirudo (5 г), Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 г) и Radix Scrophulariae (15 г), и был отварен, как сообщалосьранее7. ЭМ, растворенный в очищенной воде (0,2 мг/мл), служил положительным контролем.

2. Измерение артериального давления

ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение артериального давления проводится с помощью неинвазивного сфигмоманометра (Таблица материалов).

  1. После лечения в течение 28 дней голодайте на крысах в каждой группе в течение 12 часов и измеряйте артериальное давление.
  2. Выбирайте удерживающее устройство, соответствующее размеру крысы. Удерживающее устройство, используемое в данном исследовании, состоит из цилиндрической удерживающей сетки, брезентового чехла, термотрубки и стабилизирующей пенопластовой прокладки. Поместите крысу в ограничительную сетку, поместите ограничительную сетку в термотрубку, а затем вставьте термотрубку в брезентовый чехол.
  3. Поместите сигнальный кабель в подходящее положение под крышкой. Поместите хвост крысы в зазор, предусмотренный в крышке, и закрепите его на стабилизирующей прокладке. Для измерений предпочтительно использовать необитаемое, тихое и теплое место. Переместите крыс к месту измерения за 20-30 минут до начала измерения, чтобы крысы могли адаптироваться к среде измерения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.2-2.3 могут быть выполнены несколько раз для стабилизации крыс. После нескольких тренировок крысы привыкнут к нему и смогут очень быстро стабилизироваться, что удобно для последующего измерения артериального давления.
  4. Подсоедините соединение воздушного шланга датчика под давлением, сигнальное соединение и удерживающую трубку. Поместите датчик наддува на кончик хвоста.
  5. Измерьте артериальное давление. Пульсовая волна появляется после того, как крысиный хвост вставляется в датчик. Нажмите Старт/Стоп , чтобы начать/остановить измерение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство автоматически определит, вставлен ли хвост крысы в датчик. Когда хвост крысы не вставлен, датчик наддува не начнет нагнетание давления и не выполнит измерение.
  6. Когда проверка артериального давления будет завершена, автоматически появится меню «Результат ». Проверьте среднее значение измерения, стандартное отклонение (SD), стандартную ошибку (SE) и коэффициент вариации (CV) в меню «Результаты ».
    Примечание: Артериальное давление каждой крысы измеряли три раза, с интервалом более 2 минут, и вычисляли среднее значение.
  7. После измерения артериального давления усыпить крысу путем внутрибрюшинного введения избыточных 2% натрия пентобарбитала (100 мг/кг). Затем с помощью хирургических ножниц и зубчатых щипцов рассекают крысу слой за слоем от промежности до шеи. Переверните грудное и брюшное содержимое, перейдите к раздвоению брюшной аорты между двумя почками и соберите аорту до участка дуги аорты.

3. Окрашивание гематоксилин-эозином (ГЭ)

  1. Зафиксируйте сосудистую ткань аорты в 4% параформальдегиде не менее чем на 24 ч.
  2. Возьмите сосудистые образцы, обезвожьте их в градиентном спирте, сделайте их прозрачными в ксилоле и погрузите в парафин.
  3. После заделки сделайте непрерывные ломтики толщиной 3-5 мм. Высушите ломтики при температуре 60-70 °C, затем храните при комнатной температуре (RT).
  4. Депарафинизируйте срезы путем погружения их в ксилол I на 30 мин, ксилол II на 30 мин, 100% спирт I на 10 мин, 100% спирт II на 10 мин, 95% спирт I на 5 мин, 95% спирт II на 5 мин, 80% спирт на 5 мин, а затем промойте дистиллированной водой.
  5. Срезы окрасить в гематоксилин Харриса на 5 минут, а затем промыть в водопроводной воде в течение 5 минут. Дифференцировать в 1% соляной кислоте в течение 10 с, и тщательно промыть в водопроводной воде в течение 15 мин. Промойте секцию в аммиачной воде в течение 5 секунд, а затем тщательно промойте в водопроводной воде в течение 15 минут.
  6. Проведите микроскопическое наблюдение, окрашивайте эозином в течение 10 минут и тщательно промойте в водопроводной воде в течение 15 минут.
  7. Обезвоживайте срезы, погружая их в 80% этиловый спирт на 10 с, 95% спирт I на 5 мин, 95% спирт II на 5 мин, 100% спирт I на 10 мин, 100% спирт II на 10 мин, ксилол I на 10 мин и ксилол II на 10 мин.
  8. Запечатайте срезы с помощью нейтральной резинки.
  9. Наблюдайте за гистологическими изменениями в тканях аорты под световым микроскопом (объектив 100x, увеличение 1000x).

4. Трихромное окрашивание Массона

  1. Проведите рутинную депарафинизацию, аналогичную окрашиванию HE.
  2. Окрашивание гематоксилином: Погрузите предметные стекла в раствор гематоксилина на 10 минут, затем немедленно промойте водопроводной водой.
  3. Погрузите предметные стекла в 1% раствор соляной кислоты на несколько секунд, затем сразу после этого промойте водопроводной водой.
  4. Погрузите предметные стекла в кислотно-пурпурный краситель Лихтенштейна на 5 минут, а затем промойте водой.
  5. Погрузите предметные стекла в 1% фосфомолибдовую кислоту на 5 мин.
  6. Погрузите предметные стекла в 2% анилиновый синий окрашивающий раствор на 5 минут и 1% раствор для промывки ледяной уксусной кислотой на 1 минуту. Затем быстро промойте слайды в 95% спирте 3 раза.
  7. Выполняйте рутинное обезвоживание, прозрачность и герметизацию нейтральных десен, аналогичную окрашиванию HE.

5. Измерение Hcy методом ИФА

  1. Обезболивают крыс путем внутрибрюшинного введения 2% пентобарбитала натрия (45 мг/кг) и подтверждают глубину анестезии путем ущипывания пальца ноги. Держите крысу и обрежьте усы, чтобы избежать контакта при взятии крови. Извлеките глазные яблоки крысы с помощью изогнутых щипцов и соберите кровь в подготовленные стерильные микроцентрифужные пробирки. А затем усыпьте крысу с помощью внутрибрюшинной инъекции избыточных 2% пентобарбитала натрия (100 мг/кг).
  2. Дайте крови естественным образом свернуться в течение 10-20 минут при RT, а затем центрифугируйте (626-1409 x g) кровь в течение примерно 20 минут при 2-8 °C.
  3. Аккуратно соберите надосадочную жидкость и храните ее в холодильнике при температуре -80 °С.
  4. Разведите стандарт в пробирке в соответствии с инструкцией набора.
  5. Настройте глухие лунки (в пустые контрольные лунки образцы и ферментные реагенты не добавляются, остальные шаги те же), стандартные лунки и лунки для проб для тестирования. Добавьте в планшет 50 мкл стандартов, 40 мкл раствора для разведения пробы в лунки для пробы, а затем 10 мкл сыворотки (итоговое разведение пробы в 5 раз).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте образец на дно лунок планшета; Старайтесь не касаться стенок лунок, а аккуратно встряхивайте, чтобы перемешать.
  6. Запечатайте пластину уплотнительной пленкой и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 минут.
  7. Концентрированный моющий раствор в 30 раз разбавить дистиллированной водой в 30 раз и подготовить к применению.
  8. Осторожно снимите уплотнительную пленку, слейте жидкость и встряхните ее, чтобы удалить всю жидкость. Заполните каждую лунку моющим раствором, оставьте на 30 секунд и выбросьте. Повторите это 5 раз и постучите насухо.
  9. Добавьте по 50 мкл ферментного реагента в каждую лунку, кроме глухих лунок.
  10. Используйте герметизирующую пленку, чтобы запечатать пластину, а затем инкубируйте при температуре 37 °C в течение 30 минут.
  11. Повторите шаг 5.8.
  12. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл проявителя цвета А, затем добавьте 50 л проявителя цвета Б и осторожно встряхните, чтобы хорошо перемешать. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 10 минут при слабом освещении.
  13. Добавьте по 50 мкл раствора остановки в каждую лунку, чтобы завершить реакцию (синий цвет станет желтым).
  14. Обнулите реакцию с глухими лунками и измерьте поглощение (значение OD) каждой лунки последовательно при 450 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение следует проводить в течение 15 минут после добавления стоп-раствора.

6. Экстракция РНК и количественная ОТ-ПЦР

  1. Извлечь общую РНК.
    1. Свежую ткань аорты быстро разрежьте до нужного размера (30-50 мг/штуку) и тщательно измельчите в жидком азоте. Добавьте 1 мл реактива Тризол, хорошо перемешайте и выдержите на льду в течение 10 минут для лизирования тканей.
    2. Центрифуга при 2250 x g в течение 10 мин при 4 °C. Осторожно переложите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку без гранул.
    3. Добавьте 200 μл хлороформа, энергично встряхивайте в течение 15 секунд и выдерживайте при RT в течение 5 минут.
    4. Центрифуга при 2250 x g в течение 15 мин при 4 °C. Смесь будет разделена на три слоя: нижнюю фенол-хлороформную органическую фазу, среднюю фазу и верхнюю водную фазу.
    5. Осторожно перенесите верхнюю водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку (около 60% объема Тризола). Не отсасывайте промежуточную фазу; Небольшое количество верхней жидкости можно оставить.
    6. Добавьте равный объем изопропанола, аккуратно перемешайте, перевернув примерно 10 раз, и оставьте на 10 минут при RT.
    7. Центрифуга при 2250 x g в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте осадок РНК 1 мл 75% этанола.
    8. Центрифугируйте при 2250 x g в течение 5 минут при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и высушите на воздухе при RT в течение 5-10 минут.
    9. Растворите РНК в 15-50 мкл воды с диэтилпирокарбонатом (DEPC) и проверьте концентрацию РНК.
  2. Проведение обратной транскрипции и ОТ-кПЦР (Таблица 1)
    1. Определение экспрессии генов, связанных со стрессом эндоплазматического ретикулума (ERS) и апоптозом, с помощью qRT-PCR. Используйте общую РНК, выделенную на шаге 6.1, и обратное преобразование ее в кДНК с помощью набора для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Определение экспрессии генов с помощью системы детектирования ПЦР в реальном времени с мастер-смесью SYBR Green для ПЦР в реакционном объеме 20 мкл.
    3. Количественно проанализировать данные методом 2−ΔΔCTи выразить ее в виде n-кратной разницы относительно экспрессии β-актина. Грунтовки приведены в таблице 2.

7. Вестерн-блоттинг (WB)

  1. Извлеките общий белок ткани.
    1. Поместите небольшое количество тканевого блока в сферическую часть гомогенизатора объемом 1-2 мл, и максимально разрежьте тканевый блок чистыми ножницами.
    2. Добавьте 400 μL (w:v=1:10) буфера для лизиса RIPA и гомогенизируйте. Затем положите его на лед. Через несколько минут снова измельчить и выложить на лед. Повторите процесс измельчения несколько раз.
    3. После 30 минут лизиса с помощью пипетки перенесите лизат в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и поместите пробирку в предварительно охлажденную центрифугу с температурой 4 °C. Центрифугируйте при температуре 2250 x g в течение 10 мин и перенесите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  2. Количественное определение белка.
    1. Разбавляйте нормы белка согласно инструкции набора. Получаем градиенты норм следующим образом: 0, 25, 125, 250, 500, 1000, 1500 и 2000 нг/мкл.
    2. Возьмите 2,5 мкл образца белка и разбавьте его до 25 мкл (в 10 раз) с помощью разбавителя образца.
    3. Возьмите 96-луночный планшет и добавьте в лунки 20 мкл стандартного образца белка (в соответствии с градиентом концентрации) и целевого белка, соответственно по две лунки для каждого целевого образца белка.
    4. Приготовьте проявочный раствор (готовый к использованию), смешав жидкость А и жидкость В в соотношении 50:1, и добавьте по 200 мкл проявочного раствора в каждую лунку.
    5. Поместите 96-луночный планшет с добавленными образцами в инкубатор при температуре 37 °C на 30 минут.
    6. Определите поглощение на длине волны 562 нм.
    7. Рассчитайте концентрацию белка, которую необходимо измерить.
      1. Возьмем стандартную концентрацию белка в качестве вертикальной координаты и поглощение на длине волны 562 нм в качестве горизонтальной координаты, чтобы нарисовать стандартную кривую.
      2. Рассчитайте концентрацию целевого белка на основе формулы, полученной из стандартной кривой, и измеренной абсорбции целевого белка.
    8. Добавьте 180 мкл загрузочного буфера к 20 мкл образца белка в микроцентрифужной пробирке. Поместите пробирку центрифуги в металлическую ванну и денатурируйте при температуре 100 °C в течение 10 минут. Используйте денатурированный белок WB или храните его при температуре -20 °C.
  3. Проводят иммуноблоттинг.
    1. Настройте гель для электрофореза белка.
      1. Очистите и высушите феном стеклянную пластину для литья геля (1 мм или 1,5 мм) и закрепите ее на устройстве для литья в гель.
      2. Приготовьте 10% разделительный гель в соответствии с таблицей 3. Добавьте настроенный разделительный гель между стеклянными пластинами. Добавляйте раствор геля медленно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Затем добавьте соответствующее количество безводного этанола, чтобы разровнять жидкую поверхность сепаратора. Оставьте в режиме RT на 20-30 минут, пока гель не застынет.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чем выше молекулярная масса, тем ниже концентрация клея, в соответствии с необходимостью составления других концентраций разделительного клея.
      3. Приготовьте 5% концентрированный гель в соответствии с таблицей 3. После застывания разделительного геля слейте верхний слой безводного этанола, залейте концентрированный гель и медленно вставьте гелевый гребень, соответствующий стеклянной пластине (следите за тем, чтобы не было пузырьков воздуха). Оставьте в режиме RT на 20-30 минут, чтобы концентрированный гель застыл.
    2. Провести электрофорез.
      1. Весят 60,5 г триса, 375 г глицина и 20 г додецилсульфата натрия (SDS). Добавьте воды до 2 л, нагрейте до 60 °C и перемешайте, чтобы раствориться до образования 10-кратного раствора электрофореза. Пусть решение будет на RT; Разбавляйте его до 1x при использовании.
      2. Снимите стеклянную пластину, содержащую клей, с устройства для литья геля, протяните клеевую гребенку в потоке воды с одинаковой скоростью и в то же время слейте пузырьки воздуха из отверстия для отбора проб.
      3. Закрепите стеклянную пластину в баке для электрофореза и добавьте настроенный раствор для электрофореза 1x. Убедитесь, что внутренний бак заполнен, а внешний бак наполовину внутренний.
      4. Добавьте образец белка той же массы и 5 мкл маркера (используемого для обозначения размера белка) в лунку для добавления образца.
      5. Запустите гель при 60 В в течение 20 минут, затем при 100 В в течение 90 минут, пока буфер загрузки не опустится на дно.
    3. Выполните мембранный перенос.
      1. Взвесьте 60 г триса и 288 г глицина и добавьте воду до 2 л. Перемешайте и хорошо растворите раствор, чтобы получить 10-кратный раствор мембранного переноса, и оставьте на RT. Разбавьте в соотношении 1:2:7 (10x трансмембранный раствор: метанол: вода), чтобы получить 1x рабочий раствор.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Трансмембранный раствор следует приготовить заранее и охладить до 4 °C в холодильнике.
      2. Замочите PVDF в метаноле на соответствующий период времени (0,5-1 минута), чтобы активировать положительно заряженные группы на мембране и облегчить его связывание с отрицательно заряженными белками.
      3. Возьмите мембранный зажим для переноса и зафиксируйте его после расстановки компонентов по порядку (черная поверхность-губка-фильтр-бумага-гель-гель-мембрана PVDF-фильтр-бумага-белая поверхность в последовательности).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха; Когда появятся пузырьки воздуха, используйте ролик для вытеснения пузырьков воздуха.
      4. Поместите шину в мембранный резервуар для переноса, обратите внимание на правильное размещение электродов, положите в него два пакета со льдом и наполните его 1x жидкостью для мембранного переноса. Наконец, поместите весь трансмембранный бак в лед.
      5. Установите условия переноса мембраны на 100 В в течение 1 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Время переноса мембраны можно регулировать в зависимости от размера белка; Чем меньше молекулярная масса белка, тем короче время мембранного переноса.
    4. Выполните блокировку.
      1. Для фосфорилированных белков используйте 5% BSA (растворитель TBST) в качестве блокирующего раствора. Для нефосфорилированных белков используйте 5% обезжиренное молоко (растворитель TBST) для блокировки.
      2. Перелейте блокирующий раствор в посуду соответствующего размера. Поместите мембрану из ПВДФ в чашку и убедитесь, что мембрана из ПВДФ погружена в раствор для блокировки. Закройте миску и выдерживайте при RT в течение 1 ч.
      3. Снимите мембрану. В соответствии с дисплеем маркеров и размером каждого целевого белка разрежьте мембрану до соответствующего размера и пометьте ее серийными номерами.
    5. Инкубация антител
      1. Удалите блокирующий раствор и впитайте остатки жидкости фильтровальной бумагой. Поместите соответствующий разрезанный PVDF в соответствующие разведения антител (включая CPR78 [1:1000], TRAF2 [1:1000], p-JNK [1:1000], каспазу [1:1000] и GAPDH [1:1000]) и поместите его на вращающийся шейкер при температуре 4 °C на ночь.
      2. Добавьте 1 столовую ложку и прополощите при температуре три раза (по 10 минут каждый).
      3. Инкубировать мембрану PVDF во вторичных разведениях антител в соответствии с инструкциями производителя и инкубировать при RT в течение 1 ч.
      4. Промойте мембрану, добавив 1x TBST при RT три раза (по 10 мин каждый).
    6. Разработайте мембрану из ПВДФ.
      1. Смешайте равное количество жидкости А и жидкости В в наборе люминесцентного раствора, хорошо встряхните и приготовьте к использованию.
      2. Поместите мембрану из ПВДФ на пищевую пленку для растекания и быстро и равномерно нанесите приготовленное люминесцентное средство на мембрану быстро и равномерно. Инкубировать в течение 3 минут при RT, избегая света.
      3. Определите белковые полосы с помощью реагентов для обнаружения вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (ECL).

8. Анализ данных

  1. Выражение всех данных в виде среднего значения ± S.D. Выполнение статистического анализа с помощью одностороннего ANOVA с помощью программного обеспечения SPSS 20.0. Рассмотрим статистически значимые различия при p < 0,05.

Результаты

Как показано в таблицах 4 и 5, систолическое артериальное давление (САД) и диастолическое артериальное давление (ДАД) были значительно выше в группе МЕТ, чем в группе КОН от 1 до 4 недель. После лечения HTJDTLD САД и ДАД крыс были значительно ниже, чем в группе МЕТ. Примечатель?...

Обсуждение

Гипертония является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний, которое поражает треть взрослого населения и увеличивает риск инсульта, ишемической болезни сердца, сердечной и почечной недостаточности8. Гипертензия Н-типа – это особый тип гиперт...

Раскрытие информации

Мы заявляем, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук провинции Цзилинь (no. YDZJ202301ZYTS189).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCRYeasen,China11149EScDNA synthesis kit 
Anti-beta-actin antibodyBioss, Chinabs-0061R
Anti-caspase-3 antibodyBioss, Chinabs-0081R
Anti-GPR78 antibodyAbcam, USAab108513
Anti-JNK antibodyAbcam, USAab76572
Anti-p-JNK antibodyBioss, Chinabsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibodyBioss, Chinabs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibodyBioss, Chinabs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system Bio-RadCFX96real-time PCR detection system 
ECL Western Blot SubstratesMerck, MA, USAWBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tabletsYangzijiang Pharmaceutical Company, China20040991
FastStart SYBR Green MasterSigmaFSSGMMRO
Fructus TrichosanthisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
HirudoThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer Beijing Softron Biotechnology companyBP-2010A
Lonicerae Japonicae FlosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
MethionineSigma, USAM9500
Radix Angelicae SinensisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma GlycyrrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma NardostachyosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae CrenulataeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Salviae MiltiorrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix ScrophulariaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Rat Hcy ELISA KitsShanghai Meimian Industrial Company, ChinaMM-0293R2
RIPA bufferShanghai Beyotime Biotechnology companyP0013B

Ссылки

  1. Noone, C., Dwyer, C. P., Murphy, J., Newell, J., Molloy, G. J. Comparative effectiveness of physical activity interventions and antihypertensive pharmacological interventions in reducing blood pressure in people with hypertension: Protocol for a systematic review and network meta-analysis. Syst Rev. 7 (1), 128 (2018).
  2. Huang, K., Zhang, Z., Huang, S., Jia, Y., Zhang, M., Yun, W. The association between retinal vessel abnormalities and h-type hypertension. BMC Neurol. 21 (1), 6 (2021).
  3. Tan, Y., Nie, F., Wu, G., Guo, F., Wang, Y., Wang, L. Impact of h-type hypertension on intraplaque neovascularization assessed by contrast-enhanced ultrasound. J Atheroscler Thromb. 29 (4), 492-501 (2022).
  4. Towfighi, A., Markovic, D., Ovbiagele, B. Pronounced association of elevated serum homocysteine with stroke in subgroups of individuals: A nationwide study. J Neurol Sci. 298 (1-2), 153-157 (2010).
  5. Zhong, C., et al. High homocysteine and blood pressure related to poor outcome of acute ischemia stroke in Chinese population. Plos One. 9 (9), e107498 (2014).
  6. Hao, P., Jiang, F., Cheng, J., Ma, L., Zhang, Y., Zhao, Y. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: Evidence and potential mechanisms. J Am Coll Cardiol. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  7. Tian, T., et al. Huotan Jiedu Tongluo decoction inhibits balloon-injury-induced carotid artery intimal hyperplasia in the rat through the perk-eif2α-atf4 pathway and autophagy mediation. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536237 (2021).
  8. Simko, F., Pechanova, O. Potential roles of melatonin and chronotherapy among the new trends in hypertension treatment. J Pineal Res. 47 (2), 127-133 (2009).
  9. Li, T., et al. H-type hypertension is a risk factor for cerebral small-vessel disease. BioMed Res Int. 2020, 6498903 (2020).
  10. Rodrigo, R., Passalacqua, W., Araya, J., Orellana, M., Rivera, G. Homocysteine and essential hypertension. J Clin Pharmacol. 43 (12), 1299-1306 (2003).
  11. Lehmann, M., Gottfries, C. G., Regland, B. Identification of cognitive impairment in the elderly: Homocysteine is an early marker. Dement Geriatr Cogn. 10 (1), 12-20 (1999).
  12. dos Santos, E. F., et al. Evidence that folic acid deficiency is a major determinant of hyperhomocysteinemia in Parkinson's disease. Metab Brain Dis. 24 (2), 257-269 (2009).
  13. Zhao, W., Gao, F., Lv, L., Chen, X. The interaction of hypertension and homocysteine increases the risk of mortality among middle-aged and older population in the United States. J Hypertens. 40 (2), 254-263 (2022).
  14. Woo, K. S., et al. Hyperhomocyst(e)inemia is a risk factor for arterial endothelial dysfunction in humans. Circulation. 96 (8), 2542-2544 (1997).
  15. Lu, F., et al. The intervention of enalapril maleate and folic acid tablet on the expressions of the grp78 and chop and vascular remodeling in the vascular smooth muscle cells of h-hypertensive rats with homocysteine. Eur Rev Med Pharmaco. 22 (7), 2160-2168 (2018).
  16. López-García, P., Moreira, D. Selective forces for the origin of the eukaryotic nucleus. BioEssays. 28 (5), 525-533 (2006).
  17. Minamino, T., Komuro, I., Kitakaze, M. Endoplasmic reticulum stress as a therapeutic target in cardiovascular disease. Circ Res. 107 (9), 1071-1082 (2010).
  18. Chen, X., Cubillos-Ruiz, J. R. Endoplasmic reticulum stress signals in the tumour and its microenvironment. Nat Rev Cancer. 21 (2), 71-88 (2021).
  19. Ji, C., Kaplowitz, N. Hyperhomocysteinemia, endoplasmic reticulum stress, and alcoholic liver injury. World J Gastroentero. 10 (12), 1699-1708 (2004).
  20. Zhang, C., et al. Homocysteine induces programmed cell death in human vascular endothelial cells through activation of the unfolded protein response. J Biol Chem. 276 (38), 35867-35874 (2001).
  21. Cunard, R. Endoplasmic reticulum stress, a driver or an innocent bystander in endothelial dysfunction associated with hypertension. Cur Hypertens Rep. 19 (8), 64 (2017).
  22. Casas, C. GRP78 at the centre of the stage in cancer and neuroprotection. Front Neurosci. 11, 177 (2017).
  23. Urano, F., et al. Coupling of stress in the ER to activation of JNK protein kinases by transmembrane protein kinase ire1. Science. 287 (5453), 664-666 (2000).
  24. Borghi, A., Verstrepen, L., Beyaert, R. TRAF2 multitasking in tnf receptor-induced signaling to nf-κb, map kinases and cell death. Biochem Pharmacol. 116, 1-10 (2016).
  25. Wen, X. -. R., et al. Butylphthalide suppresses neuronal cells apoptosis and inhibits JNK-caspase3 signaling pathway after brain ischemia /reperfusion in rats. Cell Mol Neurobiol. 36 (7), 1087-1095 (2016).
  26. Jin, M., et al. Serine-threonine protein kinase activation may be an effective target for reducing neuronal apoptosis after spinal cord injury. Neural Regen Res. 10 (11), 1830-1835 (2015).
  27. Xu, F., et al. Estrogen and propofol combination therapy inhibits endoplasmic reticulum stress and remarkably attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury and ogd injury in hippocampus. Biomed Pharmacother. 108, 1596-1606 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены