Двойные внеклеточные записи в гиппокампе мыши и префронтальной коре

Резюме

Этот протокол описывает использование специально разработанного записывающего устройства и электродов для регистрации потенциалов локального поля и исследования потока информации в гиппокампе мыши и префронтальной коре.

Аннотация

Метод регистрации потенциалов локального поля (LFP) представляет собой электрофизиологический метод, используемый для измерения электрической активности локализованных популяций нейронов. Он служит важным инструментом в когнитивных исследованиях, особенно в таких областях мозга, как гиппокамп и префронтальная кора. Двойные записи LFP между этими районами представляют особый интерес, поскольку они позволяют исследовать межрегиональную связь сигналов. Однако методы выполнения этих записей редко описываются, и большинство коммерческих записывающих устройств либо дороги, либо не могут адаптироваться к конкретным экспериментальным конструкциям. В этом исследовании представлен комплексный протокол для выполнения двухэлектродных записей LFP в гиппокампе мыши и префронтальной коре для изучения влияния антипсихотических препаратов и модуляторов калиевых каналов на свойства LFP в этих областях. Этот метод позволяет измерять свойства LFP, включая спектры мощности в каждой области мозга и когерентность между ними. Кроме того, для этих экспериментов было разработано недорогое записывающее устройство, спроектированное по индивидуальному заказу. Таким образом, этот протокол предоставляет средства для записи сигналов с высоким соотношением сигнал/шум в различных областях мозга, облегчая исследование межрегиональной информационной коммуникации в мозге.

Введение

Локальные потенциалы поля (LFP) относятся к электрической активности, регистрируемой во внеклеточном пространстве, отражающей коллективную активность локализованной группы нейронов. Они демонстрируют разнообразный диапазон частот, охватывающий от медленных волн на частоте 1 Гц до быстрых колебаний на частоте 100 Гц или 200 Гц. Изменения свойств LFP использовались в качестве биомаркеров для различных неврологических расстройств, включая деменцию и шизофрению ^3,4. Анализ записей LFP может дать ценную информацию об основных патологических механизмах, связанных с этими состояниями, и потенциальных терапевтических стратегиях.

Двойная запись LFP — это метод, используемый для измерения локализованной электрической активности внутри и между двумя конкретными областями мозга. Этот метод дает ценную возможность исследовать сложную нейронную динамику и передачу сигналов, происходящих внутри и между различными областями мозга. Предыдущие исследования показали, что обнаружение изменений в нейронных свойствах отдельных областей мозга может быть сложным, но изменения в межрегиональной корковой коммуникации могут наблюдаться ^5,6. Таким образом, использование двойной записи LFP предлагает мощное средство для решения этой проблемы.

Связь между гиппокампом и префронтальным синдромом играет решающую роль в модуляции когнитивных функций, а дисфункция связана с различными неврологическими расстройствами ^7,8. Записи этих областей с двумя электродами могут предоставить информацию об этих взаимодействиях. К сожалению, имеется ограниченная информация о методах выполнения двухэлектродных записей LFP между этими областями. Кроме того, коммерчески доступные записывающие устройства, как правило, дороги и не поддаются адаптации к конкретным экспериментальным конструкциям. Традиционный метод записи LFP включает в себя использование экранированного кабеля для подключения записывающего устройства к электродам, имплантированным в мозг животного. Однако этот подход подвержен артефактам движения и шуму окружающей среды, влияющим на качество и надежность записанных сигналов.

Этот протокол описывает комплексную процедуру выполнения двухэлектродных записей LFP в гиппокампе мыши и префронтальной коре с использованием недорогого специально разработанного головного стола, который может быть размещен на голове животного. Эти методы позволяют исследователям исследовать специфические для региона колебательные паттерны в двух дискретных областях головного мозга и исследовать межрегиональный обмен информацией и связь между этими областями.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике животных Флори (Мельбурнский университет, No 22-025UM) в соответствии с Австралийским кодексом по уходу за животными и их использованию в научных целях. Для настоящего исследования использовали мышей-самцов C57BL/6 (8 недель), полученных из Центра ресурсов животных (Австралия).

1. Проектирование и изготовление головных сцен

ПРИМЕЧАНИЕ: Печатная плата Headstage представляет собой компактную четырехслойную плату размером 14 мм x 12 мм, предназначенную для размещения непосредственно на голове животного. Он использует коммерческий чип усилителя (см. Таблицу материалов), а все файлы дизайна и Gerber доступны в Интернете (ссылка на GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

1. Предоставить производителю следующие характеристики: Толщина плиты: 0,6 мм; Минимальное отслеживание/интервал: 4 мила; Минимальный размер отверстия: 0,2 мм.
2. В процессе сборки печатной платы следуйте следующему порядку:
   1. Припаяйте микросхему усилителя к плате с помощью термофена, установленного на 350 °C.
   2. Припаяйте пассивные компоненты.
   3. Припаяйте разъем SPI и разъем электрода (см. Таблицу материалов).
3. Осмотрите пайку под микроскопом для обеспечения качества. Закрепите разъем SPI на месте с помощью эпоксидной смолы для дополнительной устойчивости.
4. Для регистрации сигнала используйте программное обеспечение для записи сторонних производителей и плату управления (см. Таблицу материалов). Подробные инструкции см. в руководстве пользователя программного обеспечения.
5. Проектируемая сцена поддерживает 8 каналов. В программном обеспечении включите каналы 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 и 23 для записи.

2. Изготовление электродов

1. Отрежьте вольфрамовую проволоку с покрытием PFA (см. Таблицу материалов) до определенной длины для различных типов электродов: префронтального коркового электрода (12 мм), гиппокампа (10 мм) и заземляющего электрода (6 мм).
2. Разрежьте латунную трубку (см. Таблицу материалов) на сегменты диаметром 3 мм.
3. Удалите 2 мм покрытия на конце каждого провода с помощью зажигалки, затем надежно припаяйте электродную проволоку к латунной трубке. Латунная трубка имеет внутренний диаметр 0,45 мм и внешний диаметр 0,60 мм.
4. Для заземляющего электрода припаяйте винт из нержавеющей стали M1.2 (см. Таблицу материалов) к электроду. Нанесите на шнек флюс на основе фосфорной кислоты для улучшения пайки. После пайки очистите винт с помощью спирта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте перчатки для защиты во время процесса пайки.

3. Хирургическое вмешательство

1. Анестезируйте мышь в анестезиологической камере с 3% изофлураном и 1 л/мин потоком кислорода.
2. Поместите мышь под наркозом на грелку и закрепите ее в стереотаксической рамке (см. Таблицу материалов).
3. Отрегулируйте поддерживающую норму изофлурана до 2,5-3% и уменьшите поток кислорода до 500 мл/мин. С помощью зажима пальца ноги убедитесь, что животное все еще находится под глубокой анестезией.
4. Подкожно введите карпрофен в дозе 0,5 мг/кг и нанесите глазную мазь для защиты глаз.
5. Побрейте и простерилизуйте голову мыши, используя повидон-йод и 80% этанол.
6. Сделайте разрез 8 мм по средней линии кожи головы, удалив соединительную ткань в области разреза.
7. Нанесите перекись водорода для очистки поверхности черепа, стараясь не задеть окружающую кожу.
8. Выровняйте ориентиры брегмы и лямбды на одном уровне для точного размещения электродов (брегма и лямбда — это место, где сагиттальный шов пересекает коронковый и лямбдоидный швы).
9. Просверлите отверстия для опорного/заземляющего электрода, анкерных винтов (заусенцы 0,9 мм) и активных электродов (заусенцы 0,3 мм) в заданных координатах.
10. Прикрепите изготовленный на заказ электрод (шаг 2) к стереотаксической раме и убедитесь, что он перпендикулярен мозгу.
11. Имплантировать электрод в область СА1 гиппокампа (АП – 1,8 мм, МЛ – 1,3 мм, ДВ – 1,4 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: AP, переднезадний; ML, медиолатеральный; DV, дорсовентральный.
12. Повторная имплантация электродов в префронтальную кору (АП - 2,0 мм, МЛ - 0,3 мм, ДВ - 1,7 мм).
13. Закрепите электроды имеющимся в продаже мощным клеем и стоматологическим цементом (см. Таблицу материалов).
14. Вживите два анкерных винта 1,2 мм (AP - 1,8 мм, ML -1,6 мм) для предотвращения смещения.
15. Расположите электрод сравнения/заземления в прямом контакте с твердой мозговой оболочкой, на расстоянии 2 мм сзади и 2 мм в одностороннем порядке по отношению к ориентиру лямбда-выражения.
16. Подсоедините латунную трубку электродов к многоканальному гнездовому разъему (см. Таблицу материалов) с заземляющим электродом посередине.
17. Используйте термоусадочную трубку 0,8 мм на внешней стороне среднего штифта для изоляции.
18. Закрепите электроды, анкерные винты и соединитель клеем и стоматологическим цементом.

4. Послеоперационный уход

1. Для облегчения послеоперационной боли вводят карпрофен в дозе 5-10 мг/кг подкожно каждые 12-24 часа на основании оценки боли в течение трех дней.
2. Обеспечьте животному недельный период восстановления, прежде чем начинать какие-либо записи или экспериментальные процедуры.

5. Порядок записи

1. Прикасайтесь к животному в течение 15 минут, два раза в день, в течение трех дней подряд.
2. Возьмите мышей, осторожно сомкнув их рукой, не оказывая чрезмерного давления.
3. Поместите доску для изголовья на голову животного на 30 минут один раз в день в течение трех дней подряд.
4. В день записи акклиматизируйте животное в комнате записи в течение 30 минут.
5. Поместите животное в небольшую записывающую камеру в клетке Фарадея, чтобы уменьшить внешние электрические помехи. Прикрепите пользовательский пульт для записи.
6. Откройте программу записи и выберите частоту дискретизации 2,00 кГц. Отключите все каналы, кроме 13 и 20, выбрав каждый канал и нажав пробел.
7. В окне Аппаратная полоса пропускания установите нижнюю полосу пропускания на 2 Гц , а верхнюю полосу пропускания на 100 Гц.
8. В окне программной фильтрации настройте фильтр нижних частот на 100 Гц , а фильтр верхних частот на 2 Гц.
9. Выберите путь к хранилищу, нажав « Выбрать имя файла», а затем нажмите «Запись».
10. Начинайте каждый сеанс записи с 10-минутного периода привыкания, за которым следует 15-минутная базовая запись ЭЭГ.
11. После исходной регистрации введите препарат путем внутрибрюшинной инъекции и продолжайте запись в течение дополнительных 30 минут без промедления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию об используемых препаратах см. в разделе «Результаты».

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Показанные здесь результаты демонстрируют влияние нескольких препаратов на свойства локальных полевых потенциалов (LFP), протестированных в четырех когортах мышей-самцов C57BL/6 (n = 8 для каждой когорты; возраст: 8 недель; вес: 24,0 ± 0,42 г). Тестируемые препараты включали антипсихотический преп...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представленный здесь протокол описывает процедуру создания индивидуальной головной сцены, специально разработанной для одновременной регистрации двойных потенциалов локального поля (LFP) в гиппокампе (HIP) и префронтальной коре (PFC). Подробные шаги, представленные в этом протоколе, дают ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass tube	Albion Alloys, USA	Inside diameter of 0.45 mm
Carprofen	Rimadyl, Pfizer Animal Health
Commercial amplifier chip	Intantech	RHD 2132
Control board	Intantech	RHD recording system
Dental cement	Paladur
Heat shrinks	Panduit	0.8 mm diameter
M1.2 stainless steel screw	Watch tools	Clock and watch screw
Multichannel socket connector	Harwin, AU	1.27 mm pitch, PCB socket
PFA-coated tungsten wires	A-M SYSTEMS, USA	Inside diameter of 150 µm
Phosphoric acid-based flux	Chip Quik	CQ4LF-0.5
Recording software	Intantech	RHX recording software
Stereotactic Frame	World Precision Instruments	Mouse stereotactic instrument
Super glue	UHU	Ultra fast