Микрокомпьютерный томографический анализ коленного сустава у морских свинок Данкина-Хартли в возрасте после внутрисуставной инъекции

Резюме

Морские свинки Данкина-Хартли являются признанной животной моделью для исследований остеоартрита. Такие исследования могут принести пользу внутрисуставным инъекциям по различным причинам, включая изучение новых агентов или лечение заболеваний. Мы описываем методологию внутрисуставных инъекций в коленный сустав морским свинкам и последующий микрокомпьютерный томографический анализ для оценки изменений коленного сустава, связанных с артритом.

Аннотация

Цель данного протокола состоит в том, чтобы помочь исследователям в проведении пальпаторной техники внутрисуставной инъекции коленного сустава у морских свинок и оценке с помощью микрокомпьютерной томографии. Морские свинки Данкина-Хартли являются надежными моделями для исследований остеоартрита, поскольку у них спонтанно развивается остеоартрит в коленях. Внутрисуставная доставка лекарственного препарата является распространенным методом изучения эффектов исследуемого препарата in vivo. У людей терапевтические средства, вводимые через внутрисуставную инъекцию, могут облегчить боль и замедлить дальнейшее прогрессирование остеоартрита. Как и в случае с любым другим видом, введение иглы в суставную щель может привести к травме, которая может привести к боли, хромоте или инфекции. Такие нежелательные явления могут поставить под угрозу благополучие животных, исказить результаты исследования и потребовать привлечения дополнительных животных для достижения целей исследования. Таким образом, крайне важно разработать правильную технику инъекций для предотвращения осложнений, особенно в продольных исследованиях, требующих множественных, повторяющихся внутрисуставных инъекций. Используя представленную методику, пять морских свинок получили двусторонние инъекции в коленный сустав под общим наркозом. Через семь дней после инъекции животных гуманно усыпляли для анализа тяжести остеоартроза. После анестезии или инъекций в коленный сустав не наблюдалось никаких нежелательных явлений, включая хромоту, боль или инфекцию. Рентгеновский микрокомпьютерный томографический анализ коленного сустава может выявить патологические изменения, связанные с остеоартритом. Данные микрокомпьютерной томографии указывают на то, что остеоартрит протекает тяжелее у пожилых животных, о чем свидетельствует повышенная минеральная плотность костной ткани и толщина трабекуляра с возрастом. Эти результаты согласуются с гистологическими изменениями и модифицированными баллами Манкина, установленной и широко используемой системой оценки тяжести артрита у этих же животных. Этот протокол может быть использован для уточнения внутрисуставных инъекций морским свинкам.

Введение

Остеоартрит (ОА) поражает 32,5 миллиона взрослых американцев. Это вызвано прогрессирующей потерей суставного хряща, легким воспалением тканей в суставах и вокруг них, а также образованием остеофитов и костных кист ^1,2. Симптомы обычно проявляются на поздних стадиях заболевания, при этом современные методы лечения обеспечивают только паллиативное облегчение, а также имеют системные побочные эффекты. Нехватка модифицирующих болезнь препаратов проистекает из плохого понимания основных механизмов заболевания³. В результате, существует критическая и постоянная медицинская потребность в улучшенных препаратах для лечения ОА.

Существует несколько животных моделей ОА, которые исследуют различные компоненты патологических процессов⁴. Несмотря на то, что существует несколько хирургических моделей, включая пересечение передней крестообразной связки и дестабилизацию медиального мениска, они являются инвазивными и требуют высокого уровня технических навыков^. Химически индуцированные модели являются сравнительно менее инвазивными процедурами, обычно используемыми для изучения механизмов боли при ОА⁶. Одна из таких широко используемых моделей мышей включает индукцию ОА путем внутрисуставной инъекции йодоацетата натрия (MIA) в коленный сустав. Эта модель генерирует воспроизводимый, надежный и быстрый болевой фенотип, который может быть классифицирован путем изменения дозы MIA^. Технические детали индукции этой модели были описаны ранее⁷. Перевод этой методики на более крупных грызунов, таких как морские свинки, затруднен из-за их анатомических различий. Некоторые различия включают увеличение мускулатуры, окружающей прилегающие кости и суставное пространство у морской свинки, а также сочленяющуюся малоберцовую и большеберцовую кости по сравнению с дистальным сращением, наблюдаемым у мышей⁸. Морские свинки Данкина-Хартли, широко доступная линия морских свинок, являются признанной моделью животного остеоартрита, поскольку у них естественным образом развивается это заболевание, тем самым предлагая надежную модель для исследования влияния новых терапевтических средств, вводимых путем внутрисуставной инъекции, на прогрессирование заболевания⁹. У морских свинок Данкина-Хартли ОА начинает развиваться в три месяца, причем у самцов наблюдается ускоренное развитие и более тяжелый фенотип¹⁰. У морских свинок ОА прогрессирует с возрастом, и в 12 месяцев сопутствующая патология становится очевидной на визуализации¹¹. Спонтанные модели ОА, такие как модель Данкина-Хартли, не требуют какого-либо вмешательства для индуцирования ОА и, таким образом, повторяют развитие и прогрессирование фенотипа заболевания у людей, тем самым обеспечивая мощную трансляционную модель^. Кроме того, спонтанное развитие ОА позволяет осуществлять внутренний контроль, когда новые терапевтические средства вводятся в одностороннем порядке в одно колено данного животного. Такой внутренний контроль сводит к минимуму влияние межживотной изменчивости при анализе данных и может помочь сократить общую численность животных.

Рентгеновский микрокомпьютерный томографический анализ (μКТ) является мощным инструментом, позволяющим количественно оценить тяжесть ОА¹². КТ включает в себя сканирование нескольких рентгеновских изображений с высоким разрешением, полученных от вращающегося образца или вращающегося источника рентгеновского излучения и детектора¹³. Затем трехмерные (3D) объемные данные реконструируются в виде наложенных срезов изображения¹⁴. Поскольку минерализованная кость имеет отличный контраст на μКТ, этот метод может быть использован для оценки 3D-характеристик и выполнения количественного анализа изменений, связанных с OA 15,16,17. КТ имеет ряд преимуществ по сравнению с более широко используемыми инструментами, включая гистопатологию и анализ походки. В отличие от гистологической оценки одного или нескольких участков тканей, КТ сканирует весь сустав и предлагает более целостную оценку поражений ОА¹⁸. В то время как анализ походки может выявить симптоматические изменения в функции суставов с течением времени, изменения в суставах развиваются задолго до функциональных изменений, связанных с ОА. КТ может обеспечить более чувствительную меру развития ОА до начала хромоты. Два особенно важных количественных измерения включают минеральную плотность костной ткани и трабекулярную толщину, поскольку оба показателя увеличиваются на протяжении прогрессирования OA^19,20. Может быть полезно разделить анализ на субхондральную пластину и трабекулярную кость, поскольку они имеют разные особенности, чтобы получить более надежные измерения и сравнения.

Общая цель этого метода — помочь исследователям успешно выполнять внутрисуставные инъекции морским свинкам. В представленном протоколе использовались пяти- (n=2), девяти- (n=1) и 12-месячные (n=2) месячные самцы морских свинок Данкина-Хартли; Процедуры могут быть экстраполированы на другие штаммы морских свинок и возраст, требующие внутрисуставных инъекций в коленный сустав. В спонтанных моделях ОА, таких как модель Данкина-Хартли, прогрессирование заболевания и реакция на серийное лечение часто отслеживаются в течение длительных периодов времени, охватывающих от нескольких недель до⁹ месяцев. Этот расширенный протокол приводит к многократным внутрисуставным инъекциям, и поэтому важно иметь правильную технику инъекций для предотвращения побочных эффектов, включая боль, хромоту или инфекции, которые могут повлиять на благополучие животных и исказить результаты исследования, требуя дополнительного участия животных в исследовании. В представленном протоколе описана методика внутрисуставных инъекций морским свинкам и последующий анализ данных μКТ.

протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского университета Южной Каролины. Исследование проводилось по принципу 3R.

1. Препараты для внутрисуставных инъекций

1. Дайте морским свинкам Данкина-Хартли акклиматизироваться в помещении по крайней мере за одну неделю до начала эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались 5- (n=2), 9- (n=1) и 12- (n=2) месячных самцов морских свинок. У самцов наблюдается ускоренное развитие и более тяжелый фенотип ОА.
2. Побрейте область колена электрической бритвой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с сосками медиально.
3. Обезболите морскую свинку в изофлурановой камере, подающей 3-5% изофлуран в смеси_О2 (расход 2,5 л/мин), а затем переложите морскую свинку в носовой конус, подключенный к контуру анестезии без повторного дыхания. Корректируйте изофлуран для поддержания хирургической плоскости анестезии во время инъекции, как правило, со скоростью потока кислорода 0,5-1 л/мин и 1-3% изофлураном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрисуставные инъекции вызывают легкую, кратковременную боль. Во время процедуры животные обезболиваются, чтобы предотвратить восприятие болезненных раздражителей и повысить точность инъекций. В представленном исследовании введение анальгетических средств, включая нестероидные противовоспалительные препараты, будет препятствовать прогрессированию ОА²¹. Из-за кратковременной боли при условии анестезии и возможности анальгетиков сбить с толку модель, анальгетики не вводились, если у животных не проявлялись побочные эффекты, включая хромоту и признаки боли при пальпации суставов после инъекции. Следователям следует рассмотреть возможность использования анальгетиков для рутинных инъекций. Анальгетики рекомендуются при возникновении побочных эффектов. Схемы обезболивания должны быть обсуждены с ветеринарным врачом учреждения и одобрены IACUC до начала исследований.
4. Убедитесь, что морская свинка находится на подходящей глубине анестезии, не реагируя на защемление пальца ноги.
5. Нанесите стерильную глазную смазку на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание и травмы.
6. Разбавьте бетадин стерильной водой до 10%.
7. Разбавьте этанол 200 пробы стерильной водой до 70% этанола.
8. Приготовьте растворы для инъекций, в шкафу биобезопасности для поддержания стерильности. В представленном протоколе для введения в оба колена использовался стерильный носитель (1x фосфатный буферный раствор). Решения могут быть изменены в зависимости от целей исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно разведите свежие растворы для инъекций непосредственно перед сеансом инъекции, чтобы обеспечить стерильность. Любые неиспользованные растворы следует выбрасывать в конце каждого сеанса инъекции.
9. Наполните стерильные одноразовые инсулиновые шприцы растворами для инъекций. Позаботьтесь о том, чтобы использовать как можно меньший достижимый объем, чтобы не перегружать пространство сустава объемом. В настоящем исследовании использовалось 50 μL.
10. Положите морскую свинку и конус носа на чистую поверхность с грелкой для термоподдержки и подкладкой под голову, чтобы немного приподнять ее.
11. Наденьте хирургический халат, сетку для волос, стерильные перчатки и маску во время проведения процедуры инъекции.
12. Налейте 10% бетадина на ватный тампон и протрите обе области колена.
13. Налейте 70% этанола на ватный тампон и протрите обе области колена.
14. Повторите 1.12 и 1.13 еще два раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В демонстрационных целях в соответствующем видео показана однократная очистка колена и места инъекции 10% бетадина и 70% этанола. Впоследствии место инъекции с помощью круговых движений очищали еще два раза, чередуя эти растворы. Для достижения асептической техники рекомендуется провести три последовательных скраба с чередованием скрабических растворов и спирта.

2. Внутрисуставная инъекция

1. Поместите морскую свинку в положение лежа на спине на протяжении всей процедуры.
2. Наденьте новую пару стерильных перчаток и пальпируйте коленный сустав.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В представленном протоколе и видео использовались автоклавные нитриловые перчатки. Для асептической техники следует использовать стерильные перчатки, в том числе автоклавные нитриловые перчатки или хирургические перчатки.
3. Вручную согните колено под углом 90°.
4. Переместите палец дистальнее коленной чашечки, чтобы найти борозду дистального отдела суставного пространства, сгибая и разгибая заднюю конечность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коленная чашечка может быть пальпирована в этом положении как небольшая, твердая структура, расположенная непосредственно над суставным пространством. Большеберцовая кость может прощупываться как костная структура, расположенная дистальнее надколенника. После того, как местоположение большеберцовой кости и надколенника определено, сустав, ощущаемый как бороздка, находится между ними, дистальнее надколенника и проксимальнее большеберцовой кости.
5. Осторожно введите иглу инсулина по средней линии дистальнее надколенника в пределах суставной щели. Игла должна быть введена на 1-2 мм ниже кожи, чтобы войти в суставное пространство.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Самое большое окно доступа к суставному пространству при согнутом колене находится на передней стороне конечности по средней линии, непосредственно дистальнее коленной чашечки. Инъекция по срединной линии в передне-заднем направлении поможет точно провести инъекцию в суставное пространство без проникновения в костные структуры. Точная инъекция в суставное пространство может быть достигнута с помощью латерально-медиального доступа, хотя окно доступа уже, особенно при сгибании колена.
6. Медленно введите 50 μL раствора в шов. Убедитесь, что игла легко вставляется, а содержимое вводится без сопротивления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что игла не вводится слишком глубоко, так как это может привести к повреждению суставов или костей и привести к нежелательному воспалению и/или боли. Если бороздка, соответствующая суставному пространству, не найдена, игла может проникнуть в бедренную кость, коленную чашечку или большеберцовую кость. Поэтому полезно уверенно пальпировать борозду, соответствующую суставному пространству, чтобы предотвратить околосуставные инъекции или травмы, связанные с проникновением костных структур. Если пузырь развивается в месте инъекции под кожей, значит, инъекция была слишком поверхностной и жидкость попала в подкожное пространство. В зависимости от свойств используемого агента, препарат может проникнуть в пространство сустава путем диффузии, или может потребоваться еще одна попытка инъекции.
7. Как только это будет сделано, выбросьте иглу в корзину для острых предметов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В целях практики и тренировки введите жидкость, содержащую краситель, в суставное пространство трупа у грызуна или морской свинки аналогичного размера. Затем рассеките сустав, чтобы подтвердить место инъекции.
8. Массаж колена путем сгибания и разгибания сустава несколько раз способствует диффузии препарата в суставной щели.
9. Повторите шаги 2.1-2.5 один раз на контралатеральной конечности 1x раствором PBS.

3. Восстановление после внутрисуставного введения

1. Выключите изофлуран и поддерживайте 100% поступление кислорода до тех пор, пока животное не придет в сознание.
2. Положите животное на грелку для термоподдержки до тех пор, пока вы не сможете передвигаться.
3. Приложите пакет со льдом к колену на 30 секунд с бумажным полотенцем в качестве барьера, чтобы уменьшить отек от инъекции.
4. Оцените походку животных во время передвижения, прежде чем возвращать их в жилье.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если отмечаются какие-либо аномалии походки, могут быть оправданы анальгетики и поддерживающая терапия. Желательно еще раз оценить их походку через несколько часов после восстановления после анестезии, чтобы обеспечить нормальную подвижность.

4. Микрокомпьютерная томография (КТ)

1. Для забора ткани установите хирургическую плоскость анестезии со 100% кислородом и 5% смесью изофлурана.
2. Подтвердить операционную плоскость анестезии с отсутствием реакции на раздражитель с ущипыванием пальца ноги. Гуманно усыпить животное путем внутривенного введения ≥ 150 мг/кг пентобарбитала в соответствии с политикой учреждения и утвержденным протоколом использования животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В представленном протоколе каждый из пяти морских свинок получил по одному уколу в оба колена. Животные были обезболены и гуманно усыплены через неделю после инъекции.
3. Соберите обе задние конечности, рассекая кожу подальше от окружающей мускулатуры.
4. Затем расчлените заднюю конечность с помощью ронжеров в средней части бедренной кости и проксимальнее лодыжки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая платформа для сканирования и держатель для образцов не могли вместить всю заднюю конечность взрослой морской свинки. Большие держатели образцов доступны в продаже для образцов больших размеров.
5. Поместите ткани в нейтральный буферный раствор формалина на 72 ч для фиксации перед выполнением μКТ.
6. Откройте программное обеспечение для сканирования μКТ и поместите образец с формалином в совместимый контейнер, который поместится в папку с образцами μКТ, сохраняя ткань в поле зрения.
7. Откалибруйте аппарат μКТ для воздействия в темном и световом полях в соответствии с рекомендациями производителя.
8. Отсканируйте образец с помощью фильтра Al+Cu с температурой 18 мкм. Используйте шаг поворота 0,7° на 360° со смещенной камерой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование автоматически сохраняется.

5. Обработка изображений для оценки микроархитектурных параметров костей

1. Загрузите и установите программное обеспечение для реконструкции μКТ изображений.
2. Выберите папку с программным обеспечением и дважды щелкните мышью, чтобы открыть программное обеспечение.
3. Выберите один срез из изображений μCT, щелкнув по срезу изображения.
4. Выберите место назначения файла реконструкции. Нажмите кнопку Обзор и создайте новую папку с именем Recon. Выбранный формат файла должен быть BMP(8).
5. Проверьте компенсацию смещения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно оценка близка к правильной, но ее можно настроить вручную, чтобы сдвинуть перекрывающиеся изображения так, чтобы правый и левый края совпадали как можно точнее.
6. В разделе «Настройки» примените алгоритмы «Сглаживание», «Упрочнение луча», «Вращение CS» и «Кольцевые артефакты ».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно выбрать изображение для предварительного просмотра, чтобы определить четкость перед восстановлением. Тонкая настройка также может быть полезна для определения оптимальных настроек.
7. Нажмите кнопку Начать , чтобы начать обработку реконструкции.

6. Сбор микроархитектурных данных по реконструированным изображениям

1. Скачайте и установите Dataviewer.
2. Выберите VOI и сориентируйте образец так, чтобы он был выровнен по вертикали для упрощения анализа в последующее время.
3. Сохраните отредактированный VOI как новую папку.
4. Скачайте и установите CTAnalyser для анализа свойств костей по микроархитектурным параметрам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бесплатная версия CTAnalyser ограничена по функционалу, поэтому рекомендуется получить полную лицензию.
5. Разделите анализ на субхондральную пластину и трабекулярную кость, сохранив их как отдельный диапазон изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разделение анализа не является необходимым, но поскольку субхондральная пластинка и трабекулярная кость имеют разные особенности, отдельные анализы могут помочь в надежных измерениях и сравнении.
6. Выберите диапазон изображений для анализа, начиная с субхондральной пластины, щелкнув по срезу изображения, с которого вы хотите начать.
7. Выберите область интереса для каждого изображения, чтобы убедиться, что она охватывает кость, щелкнув вкладку «Область интереса».
8. Выберите вкладку «Двоичный выбор». Отрегулируйте гистограмму так, чтобы фон и кость были полностью разделены.
9. Выберите вкладку Минеральная плотность костной ткани (МПК). Сохраните эти данные в новой папке с данными анализа.
10. Выберите «Пользовательская обработка» и перейдите на вкладку «Внутренние».
11. Сначала выполните пороговое управление и выберите Automatic Otsu, затем Run.
12. Затем выберите Удалить пятнышки и выберите Удалить черные пятнышки, затем Запустить.
13. Повторите Удаление пятен и выберите опцию Удалить белые пятнышки, а затем выберите опцию Запустить (Run).
14. Выберите 3D-анализ и выберите Базовые значения и Дополнительные значения.
15. Повторите шаги 6.2.2-6.4.5 для сброса изображения для анализа трабекулярной кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выходной файл находится в новой папке с тем же файлом, что и данные BMD.

Результаты

Перед выполнением внутрисуставных инъекций живым животным вышеуказанный протокол был отработан на трех трупах крыс для обеспечения правильного места инъекции. Во время практических занятий 50 мкл 70% нового метиленового синего красителя вводили в оба коленных сустава по описанной выш?...

Обсуждение

Несмотря на последние достижения в симптоматическом лечении ОА, существует полная нехватка терапевтических агентов, предотвращающих начало или задержку прогрессирования ОА²⁴. В настоящее время единственным лекарством от тяжелого ОА является замена суставов, которая явл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	sterilizing agent
3D.SUITE software	Bruker		μ-CT analyzing software
Betadine Surgical Scrub	Avrio Health	67618-151-16	sterilizing agent
Insulin syringe with needle	Ulticare	91008	to perform injections
Isoflurane	Piramal	803249	anesthesize animal
Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	23-427098	Fix tissue
Nrecon Software	Bruker		μ-CT reconstruction software
Phosphate Buffered Saline	Cytiva	SH30258.01	control and diluting agent
SkyScan 1176	Bruker		to scan samples