JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье мы представляем протокол применения наносекундного импульсного электрического поля (nsPEF) для стимуляции шванновских клеток in vitro. Способность к синтезу и секреции соответствующих факторов и изменения в поведении клеток подтвердили успешную стимуляцию с использованием nsPEF. Исследование дает положительное представление о методе регенерации периферических нервов.

Аннотация

Шванновские клетки (СК) являются миелинизирующими клетками периферической нервной системы, играющими решающую роль в регенерации периферических нервов. Наносекундное импульсное электрическое поле (nsPEF) — это новый метод, применимый в электростимуляции нервов, который продемонстрировал свою эффективность в стимулировании пролиферации клеток и других биологических процессов. С целью оценки того, претерпевают ли СК значимые изменения при нПЭФ и помогают изучить потенциал новых методов регенерации периферических нервов, культивируемые клетки RSC96 подвергали стимуляции нПЭФ при 5 кВ и 10 кВ с последующим продолжением культивирования в течение 3-4 дней. Впоследствии были оценены некоторые релевантные факторы, экспрессируемые СК, чтобы продемонстрировать успешную стимуляцию, включая специфический маркерный белок, нейротрофический фактор, фактор транскрипции и регулятор миелинизации. Репрезентативные результаты показали, что nsPEF значительно усиливает пролиферацию и миграцию СК и способность синтезировать соответствующие факторы, которые положительно влияют на регенерацию периферических нервов. В то же время, более низкая экспрессия GFAP указывала на благоприятный прогноз повреждения периферических нервов. Все эти результаты показывают, что нПСЭФ обладает большим потенциалом в качестве эффективного метода лечения повреждений периферических нервов путем стимуляции СК.

Введение

Каждый год миллионы людей страдают от повреждения нервов, затрагивающих как периферическую нервную систему (ПНС), так и центральную нервную систему (ЦНС)1. Исследования показали, что аксональная восстановительная способность ЦНС после повреждения нерва достаточно ограничена, в то время как ПНС демонстрирует повышенную способность благодаря значительной пластичности СК2. Тем не менее, достижение полной регенерации после травм периферических нервов остается трудной задачей и продолжает представлять серьезную проблему для здоровья человека 3,4. В настоящее время аутотрансплантаты остаются распространенным методом лечения, несмотря на недостатки заболеваемости донорских участков и ограниченную доступность5. Эта ситуация побудила исследователей изучить альтернативные методы лечения, включая материалы6,молекулярные факторы 7 и электрическую стимуляцию (ЭС). В качестве фактора, способствующего росту аксонов и регенерации нервов8, выбор подходящего метода ЭС и изучение взаимосвязи между ЭС и СК становятся важными.

СК являются основными глиальными клетками ПНС, играющими решающую роль в регенерации ПНС 9,10. После повреждения периферических нервов СК претерпевают быструю активацию, обширноеперепрограммирование 2 и переход из миелинообразующего состояния в морфологию, поддерживающую рост, для проведения регенерации нерва2. Значительная пролиферация СК происходит на дистальном конце поврежденного нерва, в то время как СК дистальной культи подвергаются пролиферации и удлинению, образуя полосу Бангнера, которая необходима для направления аксонов к органу-мишени11. Кроме того, СК из проксимального и дистального отделов культи нерва мигрируют в нервный мостик, образуя СК, способствующие регенерации аксонов12. Кроме того, предыдущие исследования показали, что синтез и секреция соответствующих факторов, связанных с СК, изменяются в случаях регенерации периферических нервов, включая транскрипционные факторы13, нейротрофические факторы14 и регуляторы миелинизации13. Это также дает индикаторы для оценки активности СК. Основываясь на них, было широко исследовано содействие пролиферации, миграции, синтезу и секреции соответствующих факторов СК дляулучшения регенерации периферических нервов.

Предыдущие исследования продемонстрировали возможность использования ЭС для регенерации нервов1. Широко распространенное объяснение состоит в том, что ЭС может индуцировать деполяризацию клеточных мембран, изменять мембранный потенциал и влиять на функции мембранных белков, изменяя распределение зарядов на этихбиомолекулах. Тем не менее, широко применяемый интенсивный ПСЭФ может вызвать сильную боль, непроизвольные сокращения мышц и фибрилляцию сердца8. Он также повышает активность креатинкиназы (КФК), снижает мышечную силу и вызывает развитие отсроченной мышечной болезненности (СОМБ)16. nsPEF – это новый метод, который стимулирует испытуемых высоковольтными электрическими полями в течение наносекундного импульса, и постепенно используетсяв исследованиях на клеточном уровне. В предыдущих исследованиях сообщалось, что возможным обоснованием nsPEF, способствующего пролиферации клеток и активности органелл, является образование мембранных нанопор и активация ионных каналов, что приводит к увеличению концентрации цитоплазматическогоCa2+ 19. nsPEF использует технологию импульсной мощности для зарядки клеточной мембраны, производя импульсы, характеризующиеся короткой продолжительностью, быстрым временем нарастания, высокой мощностью и низкой плотностью энергии20. Эти характеристики позволяют предположить, что nsPEF может быть предпочтительным режимом с минимальными побочными эффектами стимуляции8. Кроме того, nsPEF обладает такими преимуществами, как минимально инвазивные процедуры, обратимость, регулируемость и неразрушаемость нервных тканей по сравнению с хирургическими вмешательствами. Одним из основных направлений исследований nsPEF в биомедицинской области является его применение для абляции опухолевой ткани с использованием высокоэнергетической стимуляции электрическим полем 21,22,23. Некоторые результаты исследований указывают на то, что 12-nsPEF может стимулировать периферические нервы, не вызывая повреждения24. Тем не менее, в настоящее время существуют ограниченные данные относительно применения nsPEF в области регенерации нервов. Кроме того, стимуляция СК с помощью nsPEF является новаторской попыткой, способствующей дальнейшим исследованиям in vivo и клиническим исследованиям. В этом исследовании изучается, может ли стимуляция СК nsPEF способствовать регенерации нервов и обеспечить надежную основу для последующих углубленных и систематических исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Размораживание криоконсервированных клеток RSC96

  1. Разморозьте криовиал, содержащий 1 мл клеточной суспензии, быстро встряхнув его на водяной бане при температуре 37 °С, а затем добавьте его в центрифужную пробирку, содержащую 4-6 мл готовой питательной среды, и хорошо перемешайте.
  2. Центрифугируйте при 1000 x g в течение 3-5 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 3 мл готовой питательной среды.
  3. Клеточную суспензию добавить в культуральную колбу (или чашку), содержащую 6-8 мл полной питательной среды, и инкубировать при 37 °С в течение ночи.
  4. На следующий день понаблюдайте за ростом и плотностью клеток под микроскопом.

2. Клеточный проход:

ПРИМЕЧАНИЕ: Если плотность клеток достигает 80%-90%, она готова к прохождению.

  1. Откажитесь от питательной среды и промойте клетки 1-2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS) без ионов кальция и магния.
  2. Добавьте 0,25% (масс./об.) трипсина-0,53 мМ ЭДТА в колбу для культур (1-2 мл для колбы Т25, 2-3 мл для колбы Т75) и инкубируйте при 37 °С в течение 1-2 мин.
  3. Понаблюдайте за отслоением клеток под микроскопом. Если большинство клеток стали круглыми и отделились, быстро верните колбу в рабочую зону, осторожно постучите по колбе и добавьте 3-4 мл питательной среды, содержащей 10% FBS, чтобы остановить пищеварение.
  4. Смешайте содержимое, отасуньте раствор и центрифугируйте при 1000 x g в течение 5 минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки, добавив 1-2 мл свежей питательной среды и осторожно пипетируйте.
  5. Перенесите клеточную суспензию в новую колбу T25 в соотношении 1:2 и добавьте 7 мл питательной среды.

3. Работа устройства nsPEF

  1. Ресуспендируйте клетки RSC96 в 1 мл питательной среды DMEM и перенесите их в колориметрические чашки с электродами с обеих сторон.
  2. Включите выключатель питания.
  3. Отрегулируйте параметры, вращая ручку на приборе, чтобы изменить интенсивность электрического поля. Интенсивности, установленные в этом исследовании, составляют 5 кВ/см, 10 кВ/см, 20 кВ/см и 40 кВ/см.
  4. Осторожно вращайте электроды до появления искр, позволяя элементам получить 5 импульсов nsPEF в соответствии с заданной интенсивностью поля, прежде чем немедленно разделить два электрода. После этой обработки клетки экспериментальной группы, обработанные nsPEF, и необработанные клетки контрольной группы для выполнения секций 4-6 соответственно после определенного периода культивирования клеток (1 день в этом эксперименте).

4. Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8)

  1. Приготовьте клеточную суспензию определенной концентрации из клеток RSC96, стимулированных электрической стимуляцией. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования клеток. Учитывая требования анализа CCK-8, контролируйте общее количество клеток в наборе реагентов от 1 x 103 до 1 x 106.
  2. Возьмите 10 мкл раствора CCK-8 из набора и добавьте его в 96-луночный планшет для культивирования клеток. Инкубируйте в инкубаторе сCO2 при температуре 37 °C еще от 30 минут до 4 часов.
  3. Измерьте поглощение. Используйте двухволновое измерение с длиной волны обнаружения 430-490 нм и опорной длиной волны 600-650 нм.
  4. Определение напряженности поля для последующих экспериментов на основе экспериментальных результатов пролиферации клеток. Отбирать клетки с хорошей пролиферацией для последующих экспериментов.

5. Анализ царапин на клетках

  1. В каждую лунку шестилуночного планшета засевать 3 х 105 клеток общим объемом 2 мл на лунку. Примерно через 72 часа ячейки будут перекрыты колодцем. Проведите тест на экспериментальной и контрольной группах отдельно.
  2. С помощью наконечника пипетки проведите горизонтальную линию в нижней части колодца культуры. Убедитесь, что наконечник пипетки находится вертикально, и старайтесь не наклонять его.
  3. Отсадите питательную среду и промойте PBS 2-3 раза.
  4. Добавьте в каждую лунку по 2 мл среды, не содержащей сыворотки.
  5. Поместите пластину в инкубатор с температурой 37 °C. Делайте снимки под четырехкратным увеличением инвертированного микроскопа через 0 ч и 24 ч, чтобы наблюдать за изменениями в миграции клеток.

6. Иммунофлюоресценция

  1. Пермеабилизация клеток:
    1. После осторожного пипетирования клеточных суспензий в чашки для культивирования нарисуйте круги гистологической ручкой в местах, где клетки равномерно распределены на покровном листе. Рассматривайте контрольную группу и разные экспериментальные группы отдельно.
    2. Добавьте 50-100 μл пермеабилизирующего рабочего раствора (0,25-0,5% Triton X-100) и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут. Каждый раз трижды промыть PBS в течение 5 минут.
  2. Блокирование сыворотки: добавьте 3% BSA в круги, чтобы равномерно покрыть ткань. Инкубировать при RT в течение 30 минут.
  3. Инкубация первичных антител: Осторожно удалите блокирующий раствор и добавьте в клеточные лунки соответствующим образом разведенное первичное антитело (полученное от мыши, разведенное в соотношении 1:300). Поместите планшет для культивирования клеток во влажную коробку и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C.
  4. Вторичная инкубация антител: поместите клеточную пластину на шейкер и промойте ее три раза в течение 5 минут каждый раз. Добавьте соответствующее вторичное антитело (меченый CY3 козий антимышиный IgG, разведенный в 1:300) и инкубируйте при ОТ в течение 50 минут.
  5. Ядерное окрашивание DAPI:
    1. Поместите покровное стекло в PBS (pH 7,4) на шейкер и стирайте три раза в течение 5 минут каждый раз.
    2. После аккуратного высыхания предметного стекла добавьте раствор для окрашивания DAPI (2 мкг/мл, 0,5 мл на круг) внутрь кружков и выдерживайте при температуре RT в течение 10 минут в темном помещении.
  6. Монтаж: Поместите покровное стекло в PBS (pH 7,4) на шейкер и промойте три раза в течение 5 минут каждый раз. После осторожного высыхания предметного стекла запечатайте защитное стекло с помощью антивыцветающей монтажной среды для флуоресценции.
  7. Получение изображений: возбуждение DAPI на длине волны 330-380 нм и обнаружение излучения на длине волны 420 нм; возбуждать на длине волны 465-495 нм и регистрировать излучение на длине волны 515-555 нм для AF488; возбуждать на длине волны 510-560 нм и регистрировать излучение на длине волны 590 нм для CY3; возбуждать на длине волны 608-648 нм и регистрировать излучение на длине волны 672-712 нм для CY5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Импульсные электрические поля низкой интенсивности стимулируют пролиферацию клеток
По данным анализа CCK-8, скорость пролиферации RSC96 в группе 5 кВ/см была значительно выше, чем в клетках контрольной группы. Однако по мере увеличения параметров (20 кВ/см и 40 кВ/см) скорость проли?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Согласно сообщениям, в последние годы наблюдается быстрый рост применения nsPEF. nsPEF оказывает высоконаправленное воздействие только на желаемую область, обеспечивая достаточное количество энергии для лечения, не вызывая дополнительных термических повреждений, что делает его более без...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась в рамках Национального проекта по разработке ключевых научных приборов и оборудования (NO.82027803).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Antifade mounting mediumWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1401
Anti-GFAP Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB14146-100
BSAWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGC305010
CoverslipJiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgGWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB21302
DAPI Staining ReagentWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1012
Decolorizing shakerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDDS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEFMatsusada Precision Inc.AU-60P1.6-L
Histochemical penWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6100
Membrane breaking liquidWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1204
Microscope slideWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6012
Palm centrifugeWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMS6000
PBS powderedWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG0002
PipetteWuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscopeNikon, JapanNIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibodyBeijing Bioss Biotechnology Co., LTDBS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cellsWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDSTCC30007G-1
scanister3DHISTECHPannoramic MIDI
Special cable for nsPEFTimes Microwave SystemsM17/78-RG217
Turbine mixerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMV-100

Ссылки

  1. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).
  2. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).
  3. Aguilar, Z. Nanomaterials for Medical Applications. , Newnes. (2012).
  4. Xie, S., et al. Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions. Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).
  5. Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration. J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).
  6. Daly, W. T., et al. Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair. Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).
  7. Lee, B. -K., et al. End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration. Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).
  8. Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers. Int J Mol Sci. 22 (13), 7051(2021).
  9. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).
  10. Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. W. Axon and Schwann cell partnership during nerve regrowth. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (7), 613-622 (2005).
  11. Yi, S., et al. Tau modulates Schwann cell proliferation, migration and differentiation following peripheral nerve injury. J Cell Sci. 132 (6), (2019).
  12. Min, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge. Glia. 69 (2), 235-254 (2021).
  13. Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. Transcriptional control of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).
  14. Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. C. Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100β on cultured serotonergic neurons. Brain Res. 868 (1), 113-118 (2000).
  15. Gu, Y., et al. miR-sc8 inhibits Schwann cell proliferation and migration by targeting EGFR. PLoS One. 10 (12), e0145185(2015).
  16. Dong, H. -L., et al. AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).
  17. Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. H. Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function through intracellular signal transduction mechanisms. Physiol Meas. 25 (4), 1077(2004).
  18. Haberkorn, I., Siegenthaler, L., Buchmann, L., Neutsch, L., Mathys, A. Enhancing single-cell bioconversion efficiency by harnessing nanosecond pulsed electric field processing. Biotechnol Adv. 53, 107780(2021).
  19. Ruiz-Fernández, A. R., Campos, L., Gutierrez-Maldonado, S. E., Núñez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora's box. Int J Mol Sci. 23 (11), 6158(2022).
  20. Nuccitelli, R., et al. First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method. Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).
  21. Nuccitelli, R., et al. Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).
  22. Carr, L., et al. A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model. Bioelectrochemistry. 141, 107839(2021).
  23. Hornef, J., Edelblute, C. M., Schoenbach, K. H., Heller, R., Guo, S., Jiang, C. Thermal analysis of infrared irradiation-assisted nanosecond-pulsed tumor ablation. Sci Rep. 10 (1), 5122(2020).
  24. Zuo, K. J., Gordon, T., Chan, K. M., Borschel, G. H. Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation. Exp Neurol. 332, 113397(2020).
  25. Juckett, L., Saffari, T. M., Ormseth, B., Senger, J. -L., Moore, A. M. The effect of electrical stimulation on nerve regeneration following peripheral nerve injury. Biomolecules. 12 (12), 1856(2022).
  26. Jessen, K. R., Mirsky, R. Negative regulation of myelination: relevance for development, injury, and demyelinating disease. Glia. 56 (14), 1552-1565 (2008).
  27. Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
  28. Yin, D., et al. Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF). PloS One. 7 (8), e43891(2012).
  29. Qi, F., et al. Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth. Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890(2022).
  30. Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro. Nanotechnology. 31 (35), 355102(2020).
  31. Ho, T. -C., et al. Hydrogels: Properties and applications in biomedicine. Molecules. 27 (9), 2902(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

NsPEFGFAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены