Получение высококачественных криорезов цельного кроличьего глаза

Резюме

В этом протоколе описан надежный метод получения высококачественной криосекции цельных глаз кролика. В нем подробно описаны процедуры диссекции, фиксации, встраивания и разрезания глаз кролика, которые могут быть легко адаптированы для использования в любом исследовании с использованием иммуногистохимии на больших глазах.

Аннотация

В этом протоколе описывается, как получить высококачественную криосекцию сетчатки у более крупных животных, таких как кролики. После энуклеации глаз ненадолго погружают в фиксатор. Затем роговица и радужная оболочка удаляются, а глаз оставляют на ночь для дополнительной фиксации при температуре 4 °C. После фиксации объектив снимается. Затем глаз помещают в криомолд и заполняют средой для встраивания. При удалении хрусталика встраиваемая среда получает лучший доступ к стекловидному телу и приводит к лучшей стабильности сетчатки. Важно отметить, что глаз следует инкубировать в встраиваемой среде в течение ночи, чтобы обеспечить полную инфильтрацию по всему стекловидному телу. После ночной инкубации глаз замораживают на сухом льду и разрезают. Можно получить целые срезы сетчатки для использования в иммуногистохимии. Стандартные протоколы окрашивания могут быть использованы для изучения локализации антигенов в ткани сетчатки. Соблюдение этого протокола приводит к высококачественным криосекциям сетчатки, которые могут быть использованы в любом эксперименте с использованием иммуногистохимии.

Введение

Сетчатка состоит из нескольких слоев специализированных клеток внутри глаза, которые вместе преобразуют свет в нейронные сигналы. Поскольку сетчатка играет важнейшую роль в зрении, понимание ее структуры и функции может дать ценную информацию о некоторых из наиболее распространенных причин потери зрения, таких как дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия, среди прочих.

Кролики служат удобной животной моделью в исследованиях сетчатки, поскольку они имеют ряд преимуществ по сравнению с другими моделями. Глаза кролика относительно схожи по анатомии с человеческими глазами ^1,2

протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с требованиями и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Южной Калифорнии. Четырнадцать (n = 14) кроликов в возрасте от 4 до 6 месяцев были использованы при разработке этого протокола. Использовались как самцы, так и самки животных. Все животные весили от 2,0 до 2,5 кг. Все животные содержались поодиночке. С перечнем рекомендуемых материалов и оборудования можно ознакомиться в Таблице материалов.

1. Подготовка

1. Фиксирующее препарирование.
   1. Приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-со....

Результаты

После обработки тканей стандартный протокол иммунофлюоресценции может быть использован для исследования любого количества биологических процессов в сетчатке. На рисунке 3A-C представлены репрезентативные флуоресцентные изображения среза сетчатки, .......

Обсуждение

До внедрения вышеуказанного протокола мы постоянно сталкивались с трудностями при обработке тканей глаз кролика на ИГХ. Мы адаптировали несколько протоколов для глаз более мелких животных, таких как мыши, но обнаружили, что они приводят к недостаточной фиксации и трудностям с разреза?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)