Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описан надежный метод получения высококачественной криосекции цельных глаз кролика. В нем подробно описаны процедуры диссекции, фиксации, встраивания и разрезания глаз кролика, которые могут быть легко адаптированы для использования в любом исследовании с использованием иммуногистохимии на больших глазах.

Аннотация

В этом протоколе описывается, как получить высококачественную криосекцию сетчатки у более крупных животных, таких как кролики. После энуклеации глаз ненадолго погружают в фиксатор. Затем роговица и радужная оболочка удаляются, а глаз оставляют на ночь для дополнительной фиксации при температуре 4 °C. После фиксации объектив снимается. Затем глаз помещают в криомолд и заполняют средой для встраивания. При удалении хрусталика встраиваемая среда получает лучший доступ к стекловидному телу и приводит к лучшей стабильности сетчатки. Важно отметить, что глаз следует инкубировать в встраиваемой среде в течение ночи, чтобы обеспечить полную инфильтрацию по всему стекловидному телу. После ночной инкубации глаз замораживают на сухом льду и разрезают. Можно получить целые срезы сетчатки для использования в иммуногистохимии. Стандартные протоколы окрашивания могут быть использованы для изучения локализации антигенов в ткани сетчатки. Соблюдение этого протокола приводит к высококачественным криосекциям сетчатки, которые могут быть использованы в любом эксперименте с использованием иммуногистохимии.

Введение

Сетчатка состоит из нескольких слоев специализированных клеток внутри глаза, которые вместе преобразуют свет в нейронные сигналы. Поскольку сетчатка играет важнейшую роль в зрении, понимание ее структуры и функции может дать ценную информацию о некоторых из наиболее распространенных причин потери зрения, таких как дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия, среди прочих.

Кролики служат удобной животной моделью в исследованиях сетчатки, поскольку они имеют ряд преимуществ по сравнению с другими моделями. Глаза кролика относительно схожи по анатомии с человеческими глазами 1,2

протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с требованиями и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Южной Калифорнии. Четырнадцать (n = 14) кроликов в возрасте от 4 до 6 месяцев были использованы при разработке этого протокола. Использовались как самцы, так и самки животных. Все животные весили от 2,0 до 2,5 кг. Все животные содержались поодиночке. С перечнем рекомендуемых материалов и оборудования можно ознакомиться в Таблице материалов.

1. Подготовка

  1. Фиксирующее препарирование.
    1. Приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-со....

Результаты

После обработки тканей стандартный протокол иммунофлюоресценции может быть использован для исследования любого количества биологических процессов в сетчатке. На рисунке 3A-C представлены репрезентативные флуоресцентные изображения среза сетчатки, .......

Обсуждение

До внедрения вышеуказанного протокола мы постоянно сталкивались с трудностями при обработке тканей глаз кролика на ИГХ. Мы адаптировали несколько протоколов для глаз более мелких животных, таких как мыши, но обнаружили, что они приводят к недостаточной фиксации и трудностям с разреза?.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Выражаю благодарность Розанне Кальдерон, Доминику Шейлеру и Розе Сьерра за технические советы. Это исследование было частично поддержано неограниченным грантом для отделения офтальмологии Медицинской школы Кека Университета Южной Калифорнии от Research to Prevent Blindness (AN), NIH K08EY030924 (AN), Фонда Лас-Мадринас в области экспериментальной терапии для офтальмологии (AN), премии за развитие карьеры в области исследований по предотвращению слепоты (AN), Фонда глазных рыцарей тамплиеров (AN), и Мемориальный фонд Эдварда Н. и Деллы Л. Томе (AN, KG).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm culture dishCorning353025Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tubeGenesee Scientific28-106For fixation and cryoprotection (step 1)
CryostatLeicaCM1850For cryosectioning (step 7)
Curved scissorsFine Science Tools91500-09Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPIFisher ScientificD3571Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscopeZeissStemi 2000-CUsed for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488Fisher ScientificA-11055Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555Fisher ScientificA-31570Diluted 1:1,000 in blocking buffer
ForcepsFine Science Tools91150-20Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide CoverVWR48404-453For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2R&D SystemsAF2018Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat bladesLeica Microsystems Inc.14035838926For cryosectioning (step 7)
KimwipeFisher Scientific06-666-AUsed to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65Novus BioNB100-355SSDiluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur SucroseMillipore167117Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solutionElectron Microscopy Sciences15713Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)Polysciences, Inc.18646AUsed as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1xCorning21-030-CVUsed in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15Feather08-916-5DUsed for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Used as embedding media (step 6)

Ссылки

  1. Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).
  2. Davis, F. A.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены