Получение высококачественных криорезов цельного кроличьего глаза

Резюме

В этом протоколе описан надежный метод получения высококачественной криосекции цельных глаз кролика. В нем подробно описаны процедуры диссекции, фиксации, встраивания и разрезания глаз кролика, которые могут быть легко адаптированы для использования в любом исследовании с использованием иммуногистохимии на больших глазах.

Аннотация

В этом протоколе описывается, как получить высококачественную криосекцию сетчатки у более крупных животных, таких как кролики. После энуклеации глаз ненадолго погружают в фиксатор. Затем роговица и радужная оболочка удаляются, а глаз оставляют на ночь для дополнительной фиксации при температуре 4 °C. После фиксации объектив снимается. Затем глаз помещают в криомолд и заполняют средой для встраивания. При удалении хрусталика встраиваемая среда получает лучший доступ к стекловидному телу и приводит к лучшей стабильности сетчатки. Важно отметить, что глаз следует инкубировать в встраиваемой среде в течение ночи, чтобы обеспечить полную инфильтрацию по всему стекловидному телу. После ночной инкубации глаз замораживают на сухом льду и разрезают. Можно получить целые срезы сетчатки для использования в иммуногистохимии. Стандартные протоколы окрашивания могут быть использованы для изучения локализации антигенов в ткани сетчатки. Соблюдение этого протокола приводит к высококачественным криосекциям сетчатки, которые могут быть использованы в любом эксперименте с использованием иммуногистохимии.

Введение

Сетчатка состоит из нескольких слоев специализированных клеток внутри глаза, которые вместе преобразуют свет в нейронные сигналы. Поскольку сетчатка играет важнейшую роль в зрении, понимание ее структуры и функции может дать ценную информацию о некоторых из наиболее распространенных причин потери зрения, таких как дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия, среди прочих.

Кролики служат удобной животной моделью в исследованиях сетчатки, поскольку они имеют ряд преимуществ по сравнению с другими моделями. Глаза кролика относительно схожи по анатомии с человеческими глазами ^1,2. Например, у кроликов есть область повышенной плотности фоторецепторов, известная как горизонтальная зрительная полоса, которая аналогична ямке у человека. Другие широко используемые животные модели, такие как грызуны, не имеют анатомического эквивалента. Кроме того, по сравнению с грызунами, сосудистая сеть сетчатки у кроликов довольно схожа с таковой у человека. Кроличьи глаза также относительно большие. Это делает их особенно подходящими для исследований, связанных с введением лекарств или хирургическим вмешательством в стекловидное тело или сетчатку, что в противном случае может быть затруднительно или невозможно при маленьком глазе³.

Иммуногистохимия (ИГХ) является широко используемым методом изучения локализации антигенов в ткани и имеет широкое применение в исследованиях сетчатки ^4,5,6. Поскольку сетчатка является деликатной структурой, получение полезных результатов с помощью ИГХ требует тщательной обработки тканей. Отслоение сетчатки и другие тканевые артефакты, такие как разрывы или складки сетчатки, обычно возникают во время обработки и могут мешать интерпретации результатов. Успешная обработка зависит от множества факторов, включая манипуляции с тканями, тип и продолжительность фиксации, тип среды для встраивания и технику среза 7,8,9,10. Несмотря на преимущества использования кроликов в качестве животной модели в исследованиях сетчатки, существует очень мало протоколов, описывающих успешную обработку тканей сетчатки кролика. В данной работе описан надежный метод получения высококачественных срезов сетчатки из цельных глаз кролика для использования при ИГХ.

протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с требованиями и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Южной Калифорнии. Четырнадцать (n = 14) кроликов в возрасте от 4 до 6 месяцев были использованы при разработке этого протокола. Использовались как самцы, так и самки животных. Все животные весили от 2,0 до 2,5 кг. Все животные содержались поодиночке. С перечнем рекомендуемых материалов и оборудования можно ознакомиться в Таблице материалов.

1. Подготовка

1. Фиксирующее препарирование.
   1. Приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Как минимум, требуется 50 мл фиксатора на один глаз.
2. Препарат криопротектора.
   1. Приготовьте 30% масс по объему (w/v) сахарозы в PBS. Поставьте на шейкер минимум на 15 минут, чтобы убедиться, что сахароза полностью растворилась. На один глаз требуется минимум 50 мл криопротектора.
3. Подготовка инструмента для вскрытия.
   1. Соберите две пары щипцов, одну пару изогнутых ножниц, одно лезвие скальпеля и 100-миллиметровую чашку для препарирования и поместите их рядом с микроскопом для вскрытия. Пример конфигурации показан на рисунке 1A.

2. Первичная фиксация

1. После трансконъюнктивальной энуклеации¹¹ немедленно поместите в глаз не менее 50 мл 4% PFA в PBS на льду. Убедитесь, что глаз полностью погружен в воду. Если на внешней поверхности глаза собираются пузырьки воздуха, удалите их, аккуратно встряхнув.

3. Удаление роговицы и радужной оболочки глаза

1. Через 15 мин извлеките из глаза 4% PFA в PBS и поместите его в 100-миллиметровую диссекционную чашку под препарирующим микроскопом. Наполните блюдо PBS, чтобы предотвратить пересыхание глаза.
2. Удалите роговицу.
   1. Начните с создания разреза хирургическим лезвием на 1 мм впереди лимба параллельно плоскости радужной оболочки, чтобы избежать случайного прокола нижележащих структур (рис. 1B).
   2. Вставьте изогнутые ножницы в первоначальный разрез и продолжайте резать по окружности, оставаясь на расстоянии 1 мм от лимба. Используйте щипцы для стабилизации глаза во время резки (рисунок 1C).
   3. Как только круговой разрез будет завершен, удалите роговицу щипцами и аккуратно сотрите излишки PBS с помощью лабораторной салфетки. Поместите роговицу в 30% раствор сахарозы при комнатной температуре (RT) для криозащиты или выбросьте. Криозащита завершается, когда роговица опускается, что обычно занимает менее 1 часа.
3. Удалите радужную оболочку.
   1. Начните с того, что сделайте первоначальный разрез изогнутыми ножницами через радужную оболочку. Полностью отделите радужную оболочку от остальной ткани, разрезав ее по окружности, аналогично удалению роговицы (Рисунок 1D).
   2. После того, как круговой разрез будет завершен, удалите радужную оболочку щипцами и аккуратно сотрите излишки PBS с помощью лабораторной салфетки. Поместите радужную оболочку в 30% раствор сахарозы в режим RT для криозащиты или выбросьте, как указано выше. Криозащита завершается, когда радужная оболочка опускается, что обычно занимает менее 30 минут.

4. Завершение фиксации

1. После удаления роговицы и радужной оболочки поместите глаз не менее чем в 50 мл свежеприготовленной 4% PFA в PBS и положите его на шейкер для легкого взбалтывания. Следите за тем, чтобы глаз оставался погруженным в воду во время перемешивания.
2. Держите глаз с 4% PFA в PBS при температуре 4 °C в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что 4% PFA приводит к отличному окрашиванию ИГХ при использовании в период от 16 до 24 часов при 4 °C, с более длительной продолжительностью фиксации, что приводит к увеличению неспецифического фонового окрашивания и маскировки эпитопов.

5. Снятие объектива

1. На следующее утро удалите глаз из 4% PFA в PBS и поместите его в 100-миллиметровую чашку для вскрытия под микроскопом. Наполните блюдо PBS, чтобы предотвратить пересыхание глаза.
2. Снимите объектив.
   1. Начните с осторожного захвата передней капсулы хрусталика щипцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте предельно осторожны, не давите и не тяните за хрусталик с помощью щипцов, так как это может привести к отслоению сетчатки.
   2. Осторожно вставьте ножницы в заднюю камеру лезвиями, изогнутыми кзади вдоль линзы. Сделайте первоначальный разрез через зонулы объектива изогнутыми ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте предельно осторожны, не давите и не тяните ножницами за зонулы, так как это может привести к отслоению сетчатки (Рисунок 1E).
   3. Продолжайте делать небольшие надрезы через зонулы линзы по окружности. Делайте от трех до пяти надрезов за час.
   4. Чтобы проверить, отделен ли хрусталик от остальной ткани, осторожно возьмитесь за переднюю капсулу хрусталика щипцами и попытайтесь осторожно приподнять ее. Если хрусталик не поднимается сразу, не пытайтесь тянуть больше, так как это может привести к отслоению сетчатки. Вместо этого сделайте еще несколько разрезов через оставшиеся зонулы хрусталика и повторите попытку.
   5. После отделения от остальной ткани поместите линзу в 30% раствор сахарозы в режим RT для криозащиты или выбросьте, как указано выше. Криозащита завершается, когда хрусталик опускается, что обычно занимает несколько часов.
3. Поместите глаз в не менее 50 мл 30% сахарозы в PBS при температуре 4 °C для криозащиты. Криозащита завершается, когда глаз опускается, что обычно занимает 24-48 часов. Чтобы ускорить криозащиту, замените исходный раствор сахарозы на свежий через 8-12 ч и/или оставьте глаз в растворе сахарозы в режиме РТ.

6. Встраивание

1. После завершения криозащиты извлеките глаз из 30% раствора сахарозы и поместите его в 100-миллиметровую диссекционную чашку под препарирующим микроскопом. Осторожно переверните глаз так, чтобы он был направлен вниз, чтобы удалить излишки раствора сахарозы с внутренней части глаза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не пытайтесь удалить излишки раствора с внутренней части глаза с помощью лабораторной салфетки, так как салфетка может прилипнуть к стекловидному телу и привести к отслоению сетчатки.
2. Повернув глаз вниз, аккуратно сотрите излишки раствора сахарозы с внешней части глаза с помощью салфетки.
3. Заполните одноразовую закладную форму составом для оптимальной температуры резки (ОКТ) на глубину 0,5-1,0 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта основа гарантирует, что глаз не будет касаться дна формы, что мешает криосекции в дальнейшем.
4. Поместите глаз в одноразовую закладную форму лицевой стороной вверх. Медленно заполните внутреннюю часть глаза ОКТ, уделяя особое внимание тому, чтобы избежать образования пузырьков внутри глаза. Если пузырьки все же образуются, осторожно удалите их или подтолкните к краю формы с помощью щипцов.
5. Завершите заполнение одноразовой закладной формы ОКТ. Убедитесь, что глаз полностью погружен в ОКТ и не касается внутренних поверхностей формы и не подвергается воздействию воздуха. Оберните одноразовую закладную форму, содержащую глаз в ОКТ, в парапленку; Поместите при температуре 4 °C на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, более короткие инкубационные периоды не позволяют ОКТ полностью проникнуть в стекловидное тело. В результате между сетчаткой и ОКТ часто остается слой сахарозы. Когда это происходит, сетчатка часто отделяется или полностью отрывается от остальной ткани во время криосекции, поскольку замороженная сахароза, вероятно, обеспечивает меньшую структурную поддержку, чем замороженная ОКТ, что затрудняет или даже делает невозможным получение высококачественных срезов.
6. На следующее утро поместите форму для встраивания, содержащую глаз в ОКТ, в 100-миллиметровую чашку для вскрытия под препарирующим микроскопом. Убедитесь, что задняя гиалоидная мембрана выглядит приподнятой вверх от внутренней сетчатки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подъем вверх может затруднить обзор сетчатки, что затрудняет определение ориентации.
7. Чтобы лучше определить ориентацию глаза, осторожно захватите заднюю гиалоидную мембрану спереди и попытайтесь отклеить ее с помощью щипцов, чтобы обнажить подлежащую сетчатку во время ОКТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда может быть виден гиалоидный канал, который прикрепляется к диску зрительного нерва и может быть использован в целях ориентации, поскольку головка зрительного нерва расположена в верхней части сетчатки (Рисунок 2A). Нет необходимости полностью удалять заднюю гиалоидную мембрану, так как ОКТ уже инфильтрировала стекловидное тело для выравнивания внутренней сетчатки, и любая оставшаяся мембрана не повлияет на криосекцию (Рисунок 2B). Задняя гиалоидная мембрана должна быть удалена только для ориентации, если это необходимо. Другие варианты определения ориентации включают наложение швов или другого типа метки перед энуклеацией.
8. Перенесите глаз в новую закладную форму с новой ОКТ, заполненной на глубину 0,5-1,0 см, а затем заполните новой ОКТ, как показано в шагах 6.3-6.5, чтобы убедиться, что на окончательной закладочной среде нет мусора и/или других дефектов, которые могли накопиться за ночь. Если есть возможность, аккуратно удалите ОКТ салфеткой и с внутренней стороны глаза, хотя в этом нет необходимости.
9. Нанесите на форму маркировку в целях ориентации (рисунок 2C). Ориентация глаза вверх в криоформе гарантирует, что ОКТ выровняет внутреннюю сетчатку. Гиалоидный канал, который прикрепляется к диску зрительного нерва, является важным ориентиром для определения верхней части глаза (рис. 2А).
10. Поместите маркированную форму для закладки, содержащую глаз в ОКТ, поверх сухого льда. Убедитесь, что глаз не касается внутренних поверхностей закладной формы и не подвергается воздействию воздуха. Убедитесь, что форма непосредственно соприкасается с сухим льдом, чтобы ускорить процесс замораживания (Рисунок 2D).
11. Перенесите встроенный глазок в морозильную камеру при температуре -80 °C или непосредственно в криостат для разделки (рис. 2E).

7. Криосекция

1. Установите блок так, чтобы верхняя часть глаза была обращена вверх, а нижняя часть глаза — вниз, а оставшаяся роговица и радужная оболочка — вправо (как на рисунке 2E) или влево (не показано). В качестве альтернативы можно установить блок с другой ориентацией, по желанию. При необходимости разбейте форму, чтобы мобилизовать блок, осторожно отламывая каждую сторону формы по одной и отмечая блок напрямую, чтобы не потерять ориентацию глаза.
2. Дайте блоку уравновеситься до температуры внутри криостата в течение 30-60 минут; -20 °C является хорошей отправной точкой.
3. После установки поместите новое лезвие под нужным углом, обычно параллельно вертикальной оси глаза.
4. Установите толщину профиля по желанию: профили толщиной 10-20 мкм являются хорошей отправной точкой. Пример сечения толщиной 14 мкм показан на рисунке 3A-C.
   1. Медленно и контролируемо начните секционирование блока. Убедитесь, что лезвие режет блок параллельно вертикальной оси глаза. Если нет, отрегулируйте угол соприкосновения лезвия с блоком или соответствующую ориентацию столика.
   2. Во время секционирования блока не допускайте сморщивания или скручивания секции с помощью щетки. Быстро переверните прядь и слегка надавите вниз с помощью щетки с длинным ворсом, чтобы разгладить прядь и свести к минимуму складки или завивки. Сформируйте отдельную кисть с заостренным кончиком, чтобы помочь манипуляциям с участком.
5. Прикрепите секцию к заряженному предметному стеклу, медленно перемещая предметное стекло вниз к секции. Предотвратите складывание секции на себя или иное искажение себя во время крепления, аккуратно прокатив стеклянную горку по секции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не наводите предметное стекло прямо на секцию и не прижимайте ее к секции, так как это может повредить или исказить секцию.
6. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи, прежде чем переносить в морозильную камеру при температуре -80 °C или переходить непосредственно к стандартному протоколу иммунофлюоресценции.

Результаты

После обработки тканей стандартный протокол иммунофлюоресценции может быть использован для исследования любого количества биологических процессов в сетчатке. На рисунке 3A-C представлены репрезентативные флуоресцентные изображения среза сетчатки, ...

Обсуждение

До внедрения вышеуказанного протокола мы постоянно сталкивались с трудностями при обработке тканей глаз кролика на ИГХ. Мы адаптировали несколько протоколов для глаз более мелких животных, таких как мыши, но обнаружили, что они приводят к недостаточной фиксации и трудностям с разреза?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)