Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем подробный протокол послевстраивающей коррелятивной световой и электронной микроскопии Epon с использованием флуоресцентного белка mScarlet. Этот метод позволяет поддерживать флуоресценцию и ультраструктуру одновременно. Эта методика поддается широкому спектру биологических применений.

Аннотация

Коррелятивная световая и электронная микроскопия (КЛЭМ) — это комплексная микроскопия, которая сочетает в себе информацию о локализации, полученную с помощью флуоресцентной микроскопии (ФМ), и контекст клеточной ультраструктуры, полученной с помощью электронной микроскопии (ЭМ). CLEM — это компромисс между флуоресценцией и ультраструктурой, и обычно ультраструктура нарушает флуоресценцию. По сравнению с другими гидрофильными смолами, такими как глицидилметакрилат, HM20 или K4M, Epon превосходит по свойствам сохранения ультраструктуры и секционирования. Ранее мы продемонстрировали, что mEosEM может выживать при фиксации тетраоксида осмия и встраивании эпона. Используя mEosEM, мы впервые добились поствстраивания Epon CLEM, который поддерживает флуоресценцию и ультраструктуру одновременно. Здесь мы приводим пошаговую информацию о подготовке ЭМ-образца, ФМ-визуализации, ЭМ-визуализации и выравнивании изображения. Мы также усовершенствовали процедуры идентификации одной и той же клетки, визуализированной с помощью ФМ-визуализации, во время ЭМ-визуализации и детализировали регистрацию между ФМ и ЭМ изображениями. Мы полагаем, что с помощью этого нового протокола можно легко получить коррелятивную световую и электронную микроскопию Epon после встраивания в традиционные ЭМ-установки.

Введение

Флуоресцентная микроскопия (ФМ) может быть использована для определения локализации и распределения белка-мишени. Тем не менее, контекст, который окружает целевой белок, теряется, что имеет решающее значение для тщательного изучения целевого белка. Электронная микроскопия (ЭМ) имеет высочайшее разрешение изображения, предоставляя несколько субклеточных деталей. Тем не менее, у EM отсутствует маркировка мишеней. Благодаря точному слиянию флуоресцентного изображения, полученного с помощью ФМ, с серым изображением, полученным с помощью ЭМ, коррелятивная световая и электронная микроскопия (КЛЭМ) может объединить информацию, полученную этими двумя режимами визуализации

протокол

Животноводство и эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Фуцзяньского медицинского университета. Пошаговый рабочий процесс текущего протокола показан на рисунке 1.

1. Пробоподготовка

  1. Мозг мыши
    1. Приобретите трансгенных мышей (см. Таблицу материалов) и олигонуклеотидные праймеры (см. Таблицу материалов) для генотипирования этих мышей.
    2. Перфузия и удаление неповрежденного мозга из свода черепа в соответствии с ранее опубликованным протоколом12,13<....

Результаты

Предыдущие отчеты показали, что mScarlet может нацеливаться на лизосому15. В этом протоколе AAV, экспрессирующий mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA), вводили в M1 (ML: ±1,2 AP: +1,3 DV: -1,5) мозга мыши Vglut2-ires-cre с помощью стереотаксических инструментов. В соответствии с протоколом, описанным выше, окончат?.......

Обсуждение

Представленный здесь протокол представляет собой универсальный метод визуализации, который может сочетать информацию о локализации белка-мишени из световой микроскопии (ЛМ) и контекст, окружающий белок-мишень из электронной микроскопии (ЭМ)6. В связи с ограничениями, прис.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Благодарности

Этот проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (32201235 Zhifei Fu), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2022J01287 Zhifei Fu), Исследовательским фондом передовых талантов при Фуцзяньском медицинском университете, Китай (XRCZX2021013 Zhifei Fu), Финансовым специальным научным фондом провинции Фуцзянь, Китай (22SCZZX002 Zhifei Fu), Основание Ключевой лаборатории технической оценки регуляции фертильности нечеловекообразных приматов NHC и Фуцзяньской больницы материнства и здоровья ребенка (2022-NHP-04 to Zhifei Fu). Мы благодарим Линьин Чжоу, Минся Ву, Си Линя и Янь Ху из Центра обслуживания государственных технологий Фуцзяньского ....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)Shanghai yuanye Bio-TechnologyR26284
25% Glutaraldehyde (GA)Alfa AesarA17876Hazardous chemical
Abbelight 3DNanolnsights
AcetoneSCR10000418
Ammonium hydroxideJ&K Scientific335213
BioPhotometer D30eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
CoverglassWarner64-0715
DABCO Sigma290734Hazardous chemical
DDSASPI companyGS02827Hazardous chemical
Desktop centrifugeWIGGENSMINICEN 10E
Diamond knifeDiATOMEMX6353
DMP-30SPI companyGS02823Hazardous chemical
DNA transfection reagentThermo Fisher 2696953Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812 SPI companyGS02659Hazardous chemical
EthanolSCR10009218
Fiji image JNational Institutes of Health
Fixative solution 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
FormvarSigma9823
GlycerolSCR10010618
Gold nanoparticlesCorpuscular790120-010
Gradient resinAcetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acidSCR10011118
Hydrogen peroxideSCR10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamberThermo Fisher A7816
Large gelatin capsulesElectron Microscopy Sciences70117
Mounting bufferMowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88Sigma9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2OSCR10020318
NaH2PO4 ž2H2OSCR20040718
NMASPI companyGS02828Hazardous chemical
Oligonucleotide primersTakara Biomedical Technology (Beijing)Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtomeLeicaVT1000S
Osmium tetroxideSCRL01210302Hazardous chemical
OsO4 solution1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
ParafilmAmcorPM-996
Paraformaldehyde (PFA)SCR80096618Hazardous chemical
Perfusion buffer4% PFA+0.1 M PB
PioloformSigma63148-65-2Hazardous chemical
Poly-L-lysine Sigma25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) SCR10016818
Scalpel bladesMerckS2771
Scalpel handlesMerckS2896-1EA
StereomicroscopeOLYMPUSMVX10
Transgenic miceThe Jackson LaboratoryVglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.  
Transmission electron microscope (TEM)FEITECNAL G2
UA solution (2% UA)Aqueous solution
UltramicrotomeLeicaLEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)TED PELLA19481Hazardous chemical

Ссылки

  1. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
  2. Kopek, B. G., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены