Антагонистическое действие Jiawei Shengjiang San на крысиную модель диабетической нефропатии: связано с сигнальным путем EGFR/MAPK3/1

Резюме

Здесь мы представляем протокол, описывающий сетевую фармакологию и методы молекулярного докинга для изучения механизма действия Jiawei Shengjiang San (JWSJS) при лечении диабетической нефропатии.

Аннотация

Мы стремились углубиться в механизмы, лежащие в основе действия Jiawei Shengjiang San (JWSJS) в лечении диабетической нефропатии и развертывании сетевой фармакологии. Используя методы сетевой фармакологии и молекулярного докинга, мы предсказали активные компоненты и мишени JWSJS и построили тщательную сеть «лекарство-компонент-мишень». Анализ онтологии генов (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) был использован для определения терапевтических путей и мишеней JWSJS. Autodock Vina 1.2.0 был развернут для проверки молекулярного докинга, и было проведено моделирование молекулярной динамики за 100 нс для подтверждения результатов докинга, за которым последовала проверка in vivo на животных. Результаты показали, что JWSJS имеет 227 пересекающихся мишеней с диабетической нефропатией, создавая топологию сети белок-белковых взаимодействий. Анализ обогащения KEGG показал, что JWSJS смягчает диабетическую нефропатию за счет модуляции липидов и атеросклероза, сигнального пути PI3K-Akt, апоптоза и сигнального пути HIF-1, с митоген-активируемой протеинкиназой 1 (MAPK1), MAPK3, рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и серин/треонин-протеинкиназа 1 (AKT1), идентифицированными как коллективные мишени нескольких путей. Молекулярный докинг показал, что основные компоненты JWSJS (кверцетин, пальмитолеиновая кислота и лютеолин) могут стабилизировать конформацию с тремя основными мишенями (MAPK1, MAPK3 и EGFR) посредством водородных связей. Обследования in vivo показали заметное увеличение массы тела и снижение уровня гликированного сывороточного белка (GSP), холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C), уридинтрифосфата (UTP) и уровня глюкозы в крови натощак (FBG) из-за JWSJS. Электронная микроскопия в сочетании с гематоксилином и эозином (HE) и периодическим окрашиванием кислотой-Шиффа (PAS) выявила потенциал каждой группы лечения в облегчении повреждения почек в различной степени, демонстрируя различное снижение p-EGFR, p-MAPK3/1 и BAX, а также увеличение экспрессии BCL-2 в тканях почек крыс, получавших лечение. В конечном счете, эти выводы позволяют предположить, что защитная эффективность JWSJS при диабетической нефропатии может быть связана с подавлением активации сигнального пути EGFR/MAPK3/1 и облегчением апоптоза почечных клеток.

Введение

Сахарный диабет (СД) — это хроническое заболевание, которое поражает несколько систем и может вызывать различные осложнения из-за непрерывной гипергликемии, такие как диабетическая нефропатия (ДН), ретинопатия и нейропатия¹. ДН является серьезным осложнением СД, на долю которого приходится около 30-50% случаев терминальной стадии почечной недостаточности (ТХПН)². Его клиническим проявлением является микроальбуминурия, которая может прогрессировать до ТХПН, характеризующейся увеличением объема клубочков, мезангиальной стромальной гиперплазией и утолщением базальной мембраны клубочков

протокол

Все животные содержались и использовались в соответствии с Руководством Национального исследовательского совета США по уходу и использованию лабораторных животных,^8-е издание, и были представлены в соответствии с рекомендациями ARRIVE. Исследование проводилось в соответствии с Руководством Китайского национального исследовательского совета по уходу за лабораторными животными и их использованию и было одобрено Комитетом по этике животных Хэбэйского университета китайской медицины (DWLL2019030).

1. Активные ингредиенты JWSJS и целевая....

Результаты

В соответствии с протоколом в результате анализа после скрининга и дедупликации были получены 90 активных ингредиентов JWSJS в соответствии с установленными стандартами OB и DL. Среди них 20 видов Hedysarum Multijugum Maxim, 23 вида Epimrdii Herba, 15 видов Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 видов .......

Обсуждение

В нашем исследовании использовалась комбинация сетевой фармакологии, молекулярного докинга и животных моделей in vivo . Важным шагом стало создание сети «лекарственный компонент-мишень», которая имела решающее значение для выявления потенциальных механизмов JWSJS ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F