Три стратегии индуцирования нейротрофического кератита и регенерации нервов в роговице мыши

Резюме

Здесь мы предлагаем три различных метода повреждения сенсорных волокон, иннервирующих роговицу. Эти методы облегчают изучение регенерации аксонов у мышей. Эти три метода, которые могут быть адаптированы к другим животным моделям, идеально подходят для изучения физиологии и регенерации иннервации роговицы.

Аннотация

Роговица представляет собой прозрачную ткань, которая покрывает глаз и имеет решающее значение для четкого зрения. Это самая иннервируемая ткань в организме. Эта иннервация обеспечивает чувствительность и трофическую функцию глаза и способствует сохранению целостности роговицы. Патологическое нарушение этой иннервации называется нейротрофическим кератитом. Это может быть вызвано травмой глаза, хирургическим вмешательством или заболеванием. В этом исследовании мы предлагаем три различных протокола для нанесения повреждений иннервации способами, которые повторяют три типа случаев, обычно встречающихся в клинике.

Первый способ заключается в том, чтобы сделать шлифовку эпителия глазным бором. Это включает в себя удаление эпителиального слоя, свободных нервных окончаний и суббазального сплетения способом, аналогичным операции фоторефракционной кератэктомии, выполняемой в клинике. Второй метод нацелен только на иннервацию, разделяя ее по периферии с помощью биопсийного пуансона, сохраняя целостность эпителия. Этот метод аналогичен первым этапам поклеточной кератопластики и приводит к дегенерации иннервации с последующим отрастанием аксонов в центральной части роговицы. Последний метод повреждает иннервацию трансгенной мышиной модели с помощью многофотонного микроскопа, который специфически локализует место прижигания флуоресцентных нервных волокон. Этот метод наносит тот же вред, что и фотокератит, чрезмерное воздействие ультрафиолета.

В данном исследовании описаны различные варианты изучения физиопатологии иннервации роговицы, в частности, дегенерации и регенерации аксонов. Стимуляция регенерации имеет решающее значение для предотвращения таких осложнений, как дефекты эпителия или даже перфорация роговицы. Предложенные модели могут помочь в тестировании новых фармакологических молекул или генной терапии, которые усиливают регенерацию нервов и ограничивают прогрессирование заболевания.

Введение

Роговица, которая представляет собой прозрачную поверхность глаза, состоит из трех отдельных слоев: эпителия, стромы и эндотелия. Этот орган имеет самую высокую плотность иннервации в организме и состоит в основном из сенсорных волокон (типов Аδ и С), берущих начало от глазной ветви тройничного ганглия. Сенсорные волокна проникают на периферию роговицы в середине стромы в виде больших пучков, которые разветвляются, покрывая поверхность. Затем они раздваиваются, чтобы пронзить мембрану Боумана и сформировать суббазальное сплетение, которое легко распознать по образованию вихря в центре роговицы. Эти волокна оканчиваются свободными нервными окончаниями на наружной повер....

протокол

Все эксперименты были одобрены Национальным советом по экспериментам на животных.

1. Подготовка

1. Приготовьте обезболивающий раствор кетамина-ксилазина для анестезии. Вводят кетамин в дозе 80 мг/кг и ксилазин в дозе 10 мг/кг, разбавляя 200 мкл кетамина (100 мг/мл) и 125 мкл ксилазина (20 мг/мл) в 2,175 мл стерильного 0,9% NaCl.
2. Приготовьте 0,02 мг/мл раствора бупренорфина в качестве обезболивающего раствора, добавив 100 мкл 0,3 мг/мл бупренорфина к 1400 мл стерильного 0,9% NaCl.
3. Приготовьте флуоресцентный раствор для окрашивания.
   1. С помощью тонких весов взвесьте 10 мг флуоресцеинов....

Результаты

В этом исследовании предлагается несколько протоколов для нанесения повреждений иннервации роговицы у мышей. Несмотря на то, что подобные протоколы использовались для изучения физиопатологии заживления эпителия, мы решили адаптировать и разработать новые методы исследования регене.......

Обсуждение

Нейротрофический кератит считается редким заболеванием, поражающим 5 из 10 000 человек. Однако люди, страдающие от НК из-за физических травм, таких как химические ожоги, или синдромов, таких как диабет или рассеянный склероз, не включены в^{эти статистические} данные. Кроме того, .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium