Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протоколы, которые позволяют выделить стромальные клетки из костей мыши, костного мозга, тимуса и ткани тимуса человека, совместимые с мультиомикой одиночных клеток.

Аннотация

Секвенирование одиночных клеток позволило картировать гетерогенные клеточные популяции в строме кроветворных органов. Эти методологии обеспечивают линзу, через которую можно изучать ранее неразрешенную гетерогенность в равновесном состоянии, а также изменения в представлении типа клеток, вызванные внешними стрессами или во время старения. Здесь мы представляем пошаговые протоколы выделения высококачественных популяций стромальных клеток из мышиной и тимуса человека, а также мышиной кости и костного мозга. Клетки, выделенные с помощью этих протоколов, подходят для создания высококачественных наборов данных мультиомики для отдельных клеток. Здесь обсуждается влияние переваривания образцов, истощения гемопоэтической линии, анализа/сортировки FACS, а также то, как эти факторы влияют на совместимость с секвенированием одиночных клеток. С примерами профилей FACS, указывающих на успешную и неэффективную диссоциацию и выход стромальных клеток ниже по потоку в анализе после секвенирования, предоставляются узнаваемые указатели для пользователей. Учет специфических требований к стромальным клеткам имеет решающее значение для получения высококачественных и воспроизводимых результатов, которые могут продвинуть знания в этой области.

Введение

У здорового взрослого человека de novo производство клеток крови происходит в костном мозге и вилочковой железе. Стромальные клетки в этих участках необходимы для поддержания кроветворения, но строма составляет менее 1% ткани 1,2,3,4. Таким образом, получение чистых изолятов стромы, поддерживающих кроветворение, представляет собой значительную проблему, особенно для мультиомики одиночных клеток, которая требует целесообразной обработки для получения образцов высокого качества. Компоненты различных коктейлей для пищеварения могут мешать опред....

протокол

Все работы с человеческими тканями проводились после одобрения Совета по внутреннему контролю Массачусетской больницы общего профиля (IRB). Все процедуры на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля. В настоящем исследовании использовались мыши C57Bl/6 в возрасте 8-10 недель, а также самцы и самки. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка тимусовой ткани мыши

  1. Приготовьте следующие буферы и растворы.
    1. Среда 199 (M199) с 2% (v/v) фетальной....

Результаты

Эти протоколы позволяют получить воспроизводимые разновидности стромальных клеток из тимуса и костного мозга, пригодные для проточного цитометрического анализа, а также для мультиомики одиночных клеток, такой как секвенирование scRNA. Мышиная ткань тимуса претерпевает значительное ре.......

Обсуждение

Стромальные клетки в кроветворных органах имеют решающее значение для нормального производства крови, и нарушения стромы кроветворения могут привести к серьезным нарушениям поддержания кроветворения и реакции на стресс 9,23,24. Понима?.......

Раскрытие информации

D.T.S. является директором и акционером компаний Agios Therapeutics и Editas Medicines; основателем, директором, акционером и членом научно-консультативного совета Magenta Therapeutics и LifeVault Bio, акционером и основателем Fate Therapeutics и Garuda Therapeutics, а также директором, основателем и акционером Clear Creek Bio, консультантом FOG Pharma, Inzen Therapeutics и VCanBio, а также получателем спонсорского финансирования исследований от Sumitomo Dianippon. Д.Т.С и К.Г. являются изобретателями патентных US20220143099A1.

Благодарности

Нам оказали экспертную техническую поддержку специалисты со стороны центра проточной цитометрии HSCI-CRM в Массачусетской больнице общего профиля и центра Bauer Core Facility в Гарвардском университете. Т.К. и К.Г. были поддержаны Шведским исследовательским советом, а К.М. — Немецким научно-исследовательским обществом. Мы благодарим Сергея Исаева и И-Сю Ли за помощь в анализе данных секвенирования РНК одиночных клеток.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITCBD Biosciences643510
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 miceJackson664Males or females, 8-12 weeks old
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µmFisher Scientific08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)Biolegend422801
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083 2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kitStemCell Technologies19860
Fetal Bovine SerumGibcoA31605-01Qualified One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
Mouse anti-human CD235a-BV77BD Biosciences740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Mouse anti-human CD45-BV77Biolegend304050
Mouse anti-human CD4-BV605BD Biosciences562658
Mouse anti-human CD66b-FITCBD Biosciences555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Mouse anti-human EpCam-BV421Biolegend324220
Protector RNase InhibitorMillipore Sigma3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rat anti-mouse CD11b-BiotinBiolegend101204
Rat anti-mouse CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rat anti-mouse CD31-BV421Biolegend102424
Rat anti-mouse CD3-BiotinBiolegend100244
Rat anti-mouse CD45.2-BiotinBiolegend109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Rat anti-mouse CD51-PEBiolegend104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend108404
Rat anti-mouse Ter119-BiotinBiolegend116204
Rat anti-mouse Ter119-PEBiolegend116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiochemicalLS004107

Ссылки

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induc....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены