JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описывается новый метод количественного определения внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве флуоресцентного зонда красителя с использованием высокопроизводительного скринингового подхода. В протоколе описаны методы количественной оценки внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) в трех различных клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы.

Аннотация

Активные формы кислорода (АФК) играют ключевую роль в регуляции клеточного метаболизма при физиологических и патологических процессах. Физиологическая продукция АФК играет центральную роль в пространственной и временной модуляции нормальных клеточных функций, таких как пролиферация, передача сигналов, апоптоз и старение. Напротив, хроническое перепроизводство АФК ответственно за широкий спектр заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания и диабет. Таким образом, точная и воспроизводимая количественная оценка уровней АФК имеет важное значение для понимания нормальной функциональности клеток. Методы флуоресцентной визуализации для характеристики внутриклеточных видов АФК являются распространенным подходом. Во многих протоколах визуализации АФК, описанных в литературе, используется краситель 2'-7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA). Тем не менее, этот краситель страдает от существенных ограничений в его использовании и интерпретируемости. Текущий протокол демонстрирует использование флуоресцентного зонда дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве альтернативного метода количественной оценки общего производства АФК в условиях высокой пропускной способности. Высокопроизводительная платформа визуализации CX7 Cellomics использовалась для измерения и количественной оценки производства АФК. Данное исследование проводилось на трех гепатоцеллюлярных клеточных линиях рака - HepG2, JHH4 и HUH-7. Этот протокол содержит подробное описание различных процедур, связанных с оценкой АФК в клетках, включая приготовление раствора ДГЭ, инкубацию клеток с раствором ДГЭ и измерение интенсивности ДГЭ, необходимой для характеристики продукции АФК. Этот протокол демонстрирует, что флуоресцентный краситель DHE является надежным и воспроизводимым выбором для характеристики внутриклеточного производства АФК с высокой пропускной способностью. Высокопроизводительные подходы к измерению продукции АФК, вероятно, будут полезны в различных исследованиях, таких как токсикология, скрининг лекарств и биология рака.

Введение

Активные формы кислорода (АФК) представляют собой группу встречающихся в природе, высокореакционноспособных и нестабильных во времени химических радикалов, образующихся как часть нормального клеточного метаболизма в клетках. АФК играет ключевую и существенную роль в модуляции нормальных физиологических и биохимических процессов, происходящих в клетках 1,2. Основным источником продукции АФК в клетках является митохондриальная цепь переноса электронов (ETC) как часть нормального биоэнергетического цикла. Важными дополнительными источниками производства АФК являются ферментативные реакции, такие как клеточные НАДФН-оксидазы в клетках. Метаболизм молекул пищи (например, глюкозы) происходит через путь окислительного фосфорилирования в митохондриальном матриксе. Исходный уровень продукции АФК необходим для регуляции нормальных физиологических сигнальных процессов клеток. Известно, что многие ключевые белковые молекулы, которые являются частью метаболических сигнальных путей глюкозы (например, Akt и PTEN), реагируют на внутриклеточные уровни АФК. Кроме того, АФК продуцируются различными внутриклеточными ферментами, такими как ксантиноксидаза, синтаза оксида азота и пероксисомальные компоненты, как часть клеточных ферментативных путей 1,2. В отличие от естественных источников АФК, некоторые факторы окружающей среды, такие как ксенобиотики, инфекционные агенты, ультрафиолетовое излучение, загрязнение, курение сигарет и радиация, также приводят к чрезмерной выработке АФК, которые являются ключевым фактором внутриклеточного окислительного стресса 1,3. Повышенный клеточный окислительный стресс может привести к повреждению нативных биомолекул внутри клетки, таких как липиды, белки и ДНК, вызывая различные заболевания, такие как рак, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, хроническое воспаление и нейродегенеративные расстройства 1,3,4. Таким образом, точные измерения АФК необходимы для понимания клеточных механизмов, участвующих в патофизиологии заболеваний, вызванных окислительным стрессом.

Из-за коротких временных рамок производства и элиминации АФК внутри клеток количественные измерения различных радикалов АФК остаются сложной задачей. Такие методы, как электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)5, жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и визуализация на основе флуоресцентного зонда, используются для измерения различных клеточных АФК6. В то время как такие методы, как ЭПР и ВЭЖХ, дают количественно точные оценки, эти методы включают в себя разрушение пространственной морфологии клеток и обычно проводятся в форме глобальных и массовых измерений образца. В отличие от этого, методы, основанные на визуализации, такие как методы на основе флуоресцентных зондов, сохраняют клеточную морфологию и пространственный контекст генерации АФК. Однако специфичность различных флуоресцентных зондов для различных типов радикалов АФК не была хорошо установлена 7,8. Несколько флуоресцентных зондов, таких как дигидроэтидий (ДГЭ), дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA), дигидрородамин (DHR), диметилантрацен (DMA), 2,7-дихлордигидрофлуресцеин (DCFH), 1,3-дифенилизобензофуран (DPBF) и MitoSox, доступны для коммерческого обнаружения АФК. В последние десятилетия DHE, MitoSox и DCFH-DA являются широко используемыми флуоресцентными красителями для измерения АФК в клетках и тканях 8,9. DCFH-DA является широко используемым красителем для обнаружения внутриклеточногоH2O2и окислительного стресса. Несмотря на популярность DCFH-DA, многочисленные предыдущие исследования показали, что он не может быть надежно использован для измерения внутриклеточного уровняH2O2и других уровней АФК 8,9,10,11,12,13,14.

Напротив, флуоресцентный зонд дигидроэтидий (ДГЭ) проявляет специфическую реакцию на внутриклеточный супероксидный радикал (O2-). В то время как супероксидный радикал является одним из многих видов АФК, наблюдаемых в клетках, он является важным радикалом, участвующим в восстановлении переходных металлов, превращении в пероксинитрат и образовании гидропероксидов, а также в других внутриклеточных эффектах. ДГЭ быстро поглощается клетками и имеет флуоресцентное излучение в красном диапазоне длин волн15. При реакции с супероксидным радикалом ДГЭ образует красный флуоресцентный продукт, 2-гидроксиэтидий (2-OH-E+). Таким образом, ДГЭ можно рассматривать как специфический зонд для детектирования супероксида. Однако ДГЭ также может подвергаться неспецифическому окислению ONOO- или OH, H2O2и цитохромом C с образованием второго продукта флуоресценции, этидия E+, который может влиять на измеренные уровни 2-OH-E+. Тем не менее, эти продукты 2-OH E+ и E+ в сочетании представляют собой основную часть общего количества клеточных видов АФК, наблюдаемых внутри клетки при окрашивании ДГЭ. E+ интеркалируется в ДНК, значительно усиливая ее флуоресценцию 8,9,10,11,13,14,15,16. Поскольку спектры флуоресценции этидия и 2-гидроксиэтидия различаются лишь незначительно, большинство уровней АФК, наблюдаемых в клетке, вторичной по отношению к производству супероксида, могут быть обнаружены и измерены с помощью продуктов флуоресценции ДГЭ. Эти виды АФК идентифицированы с помощью возбуждения с длиной волны 480 нм и излучения с длиной волны 610 нм 15,16,17.

В дополнение к выбору конкретного флуоресцентного датчика для обнаружения АФК, важно выбрать чувствительный метод обнаружения для измерения внутриклеточных АФК. Таким образом, точная оценка внутриклеточных уровней АФК является ключом к выявлению нарушений окислительно-восстановительного баланса, возникающих в больных клетках или клетках, подвергшихся воздействию различных стрессоров окружающей среды, таких как радиация, токсикологические соединения и генотоксическиеагенты. Поскольку АФК является часто встречающимся явлением в клетках, которое отвечает за регуляцию различных сигнальных активностей клеток, надежные методы обнаружения АФК имеют важное значение. Чтобы обеспечить такую высокопроизводительную оценку продукции АФК в клетках, этот протокол использует платформу скрининга с высоким содержанием (HCS) для измерения видов АФК. Существующий протокол позволяет проводить высокопроизводительный анализ внутриклеточной продукции АФК, что имеет решающее значение во многих токсикологических исследованиях19. Этот протокол направлен на предоставление простого и универсального решения для обнаружения и измерения внутриклеточных АФК в адгезивных клетках гепатоцеллюлярной карциномы. Химические реагенты H2O2 и менадион используются в качестве мощных стимуляторов АФК для измерения относительных уровней продукции АФК в контролируемых и высокопроизводительных условиях. Этот протокол может быть точно настроен для измерения продукции АФК в адгезивных и неадгезивных клетках при соответствующих условиях, если это необходимо.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Клеточная культура

  1. Засейте исследуемые клетки (клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2, HUH7 и JHH4) в 96-луночную пластину с плотностью засева 10 000 клеток/лунку при конечном объеме посева 200 мкл на лунку.
    1. Перед культивированием клеток HepG2 покройте 96 лунок для планшетов коллагеном IV типа (50 мкг/мл) в течение 2 ч при комнатной температуре (RT). Чтобы избежать затвердевания исходного коллагена, поместите исходный раствор в лед и впоследствии начните процесс разбавления до желаемой концентрации.
    2. После 2-часового инкубационного периода отсасывайте излишки коллагена и трижды промойте лунки с помощью 1x PBS.
  2. Культивируйте клетки в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco в течение ночи при температуре 37 °C и концентрацииCO2 5% во влажном инкубаторе.
  3. На следующий день или по достижении 80%-90% слияния, в зависимости от того, что наступит раньше, обработайте клеткиH2O2 (необработанные, 250 мкМ, 500 мкМ, 750 мкМ и 1000 мкМ) и Menadione (необработанные, 25 мкМ, 50 мкМ, 75 мкМ, 100 мкМ) соответственно в течение 30 мин, чтобы вызвать репрезентативный окислительный стресс.
  4. В качестве альтернативы можно протестировать клетки с помощью желаемого тестового вещества, способного индуцировать окислительный стресс в клетках.

2. Приготовление сырья и разбавленного раствора для окрашивания клеток ДГЭ

  1. Приготовьте исходный раствор ДГЭ (5 мг/мл или 15,9 мМ), растворив 5 мг ДГЭ в 1 мл ДМСО.
  2. Разбавьте исходный раствор DHE двойной дистиллированной автоклавной водой до конечной концентрации 100 мкМ.
  3. Чтобы избежать процесса замораживания и оттаивания красителя (который со временем может повредить флуоресцентные свойства), приготовьте несколько аликвот в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл с концентрацией 100 мкМ и храните их при -20 °C.
  4. Для достижения конечной рабочей концентрации 10 мкМ используйте аликвоту концентрации ДГЭ 100 мкМ и разбавляйте ее предварительно нагретой средой DMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор должен быть приготовлен свежим в день эксперимента.
  5. Встряхните рабочий раствор флуоресцентного красителя в течение 5-10 с, чтобы обеспечить правильное перемешивание красителя.

3. Процесс окрашивания DHE

  1. Извлеките среду, содержащую лекарственное средство или тестовое вещество, из каждой лунки и осторожно промойте ее один раз с помощью 1x PBS или DMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этапов добавления или промывки в эксперименте крайне важно избегать прямого контакта между клетками и пипеттором. Этого можно достичь, аккуратно пипетируя PBS вдоль стенок лунок, чтобы свести к минимуму любое потенциальное механическое повреждение клеток. Обеспечение того, чтобы пипеттор не касался клеток напрямую, поможет сохранить целостность и жизнеспособность клеток на протяжении всего эксперимента.
  2. Добавьте в каждую лунку 100 мкл ДМЭМ-среды, содержащей 10 мкМ ДГЭ (рабочего раствора), и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин.
  3. После 30-минутного инкубационного периода удалите среду, содержащую ДГЭ, и осторожно промойте каждую лунку три раза 1x фосфатно-солевым буфером (PBS). Это может быть выполнено с помощью многоканального пипетки, чтобы обеспечить быстрое выполнение.
  4. Добавьте 200 мкл 1x PBS в каждую лунку с ядерным красителем Hoechst 33342 в течение 10 мин при RT.
  5. Извлеките раствор для окрашивания ядер Hoechst 33342 из лунки и добавьте 200 мкл 1x PBS в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения фиксированных клеток следуйте тому же протоколу, что и для живых клеток, с одним дополнительным этапом добавления 4% PFA в течение 5 минут после обработки и окрашивания DHE. Удалите раствор PFA и промойте ячейки с помощью 1x PBS. Затем инкубируют клетки с ядерным красителем в течение 10 минут.
  6. Переместите планшет на платформу для скрининга с высоким содержанием, флуоресцентную микроскопию или планшет для считывания пластин для получения изображения как можно быстрее.

4. Получение изображений и измерение интенсивности

  1. Загрузка пластин
    1. Откройте программное обеспечение Cellomics CX7 для скрининга с высоким содержанием (HCS) для сбора данных.
    2. Тщательно откалибруйте платформу визуализации в соответствии со спецификациями производителя заранее с помощью специальной 96-луночной пластины для использования, чтобы избежать нечетких или размытых изображений в данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Многолуночные планшеты различных производителей могут иметь различные свойства материала и могут влиять на качество получаемых окончательных изображений.
    3. После калибровки сохраните системные параметры, специфичные для марки пластины, в базе данных прибора и повторно используйте их для сбора данных в будущем.
    4. Осторожно поместите планшет с подготовленными образцами на нагретый столик системы визуализации HCS. Убедитесь, что пластина надежно расположена и находится в правильной ориентации для визуализации на держателе микропланшета (т. е. найдите этикетку с маркировкой A1 на столе считывателя, затем поверните микропланшет так, чтобы расположение лунки A1 совпадало с углом наклейки).
    5. Осторожно надавите на микропластину, чтобы она плотно прилегала к сцене. Неравномерное выравнивание пластины в системе HCS может привести к ошибкам при получении изображения.
    6. После того, как пластина будет установлена на место, нажмите и удерживайте клавишу Ctrl , затем нажмите Ctrl-OK в диалоговом окне Загрузка/Выгрузка пластины в программном обеспечении.
  2. Выбор параметров визуализации
    1. В системе визуализации HCS откройте режим Target Activation (Активация мишени) в интерфейсе Cellomics bio-applications (Биоприложения Cellomics) и создайте новый протокол с использованием двухканального протокола настройки, совместимого с (а) ядерным окрашиванием и (б) сбором данных флуоресцентного зонда DHE. В действующем протоколе фильтры 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS и 386_BGS_RS использовались для (а) ядерного окрашивания Hoechst 33342, (б) общего производства АФК и (в) обнаружения супероксидных радикалов, соответственно. Выбор этих фильтров был обусловлен специфическим перекрытием эмиссионных свойств каждого красителя (DAPI и DHE), используемых в рамках этого протокола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соглашение об именовании фильтров, например, 386-23_BGRFRN_BGRFRN, относится к возбуждению образца светом с длиной волны 386 нм и шириной волны 23 нм, за которым следует дихроичный фильтр, пропускающий синий (B), зеленый (G), красный (R), дальний красный (FR) и ближний инфракрасный (N) свет в определенных диапазонах длин волн, а 386_BGS_RS относится к эмиссионному фильтру, который пропускает свет с длиной волны излучения BGS и RS после дихроичного.
    2. При необходимости укажите цели процесса получения изображения в интерфейсе программного протокола, такие как 10-кратное или 20-кратное увеличение.
    3. Выберите подходящее увеличение объектива в зависимости от желаемого уровня детализации изображения и разрешения, необходимого для эксперимента. Тем не менее, решение каждой задачи фиксировано. Более высокая детализация разрешения потребует изменения цели на платформе. В текущем протоколе используется объектив 20x, 0,45 NA, который является частью платформы скрининга с высоким содержанием, используемой в этом протоколе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 20-кратный объектив представляет собой хороший компромисс между разрешением изображения, детализацией и скоростью сбора, необходимой для фиксации изменений АФК с течением времени. Можно выбрать объективы с более высоким увеличением (например, 40X), однако это приведет к увеличению времени захвата.
    4. Укажите настройки экспозиции камеры для получения изображений, такие как время экспозиции, объединение камеры и интервал z-стека, в соответствии с конкретными требованиями протокола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции (часто в миллисекундах) варьируется в зависимости от уровня сигнала и чувствительности конкретных используемых флуорофоров. Это также может незначительно отличаться от эксперимента к эксперименту в зависимости от концентрации красителя и качества окрашивания. В действующем протоколе параметры захвата зафиксированы следующим образом - Целевой % - 35%, режим получения изображения - 1104 x 1104 (с биннингом 2x2), а объектив 20x, 0,45 NA. Эти параметры могут быть заданы в соответствии с конкретными условиями эксперимента.
  3. Параметры конфигурации образа
    ПРИМЕЧАНИЕ: После настройки параметров изображения можно запустить процесс сбора изображений с помощью программного интерфейса.
    1. Параметры коллекции изображений
      1. Идентификация основного интересующего объекта слежения (ядра клеток) с помощью различных алгоритмов, доступных в приборе (оптика - изоданные, фиксированные и треугольные).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе используется метод изоданных для идентификации и маркировки первичного объекта.
      2. Сегментируйте объект (если таковой имеется) по форме или параметру интенсивности.
      3. Проверьте первичный объект на основе требуемых параметров размера, формы и интенсивности, уникальных для каждого типа ячейки.
      4. Затем определите «область интереса» (ROI) вокруг этого основного объекта.
        ПРИМЕЧАНИЕ: ROI является ключевым параметром сбора данных, который определяет место, где интенсивность флуоресцентного красителя определяется как постоянная и воспроизводимая для разных типов клеток. ROI определяет ключевые параметры (например, интенсивность красителя), которые измеряются для каждого первичного объекта слежения (т.е. ячейки) в разных каналах прибора. ROI может быть определен в виде круга или кольца вокруг ядра каждой клетки. Программное обеспечение HCS автоматически получает интенсивность маркера флуоресцентного красителя DHE в канале 2 в пределах ROI для каждой клетки, которая сегментируется и анализируется в автоматическом режиме.
      5. Установите круг размером 20 мкм вокруг первичного объекта (ядра). Расстояние 20 мкм было выбрано в этом исследовании на основе приблизительных размеров различных клеточных линий, используемых в этом протоколе (HepG2, JHH-4 и HUH-7). Кольцевая ROI 20 мкм вокруг клеток позволила получить интенсивность флуоресценции последовательным и воспроизводимым образом.
        ПРИМЕЧАНИЕ Ключевым параметром при выборе ROI является возможность адекватного покрытия площади ячейки; размер кругового ROI зависит от размера ячейки. Для более крупных ячеек может потребоваться более высокая рентабельность инвестиций, и наоборот для более низкой рентабельности инвестиций. Эти параметры должны быть определены заранее для каждого интересующего типа клеток и флуоресцентного красителя.
  4. Характеристика генеральной совокупности и выбор признаков для хранения
    1. После того, как различные параметры сбора данных определены в протоколе визуализации HCS, переведите систему HCS в режим сбора данных.
    2. Параметры получения изображений для этого протокола были установлены следующим образом: ограничение сканирования 1000 ячеек/лунку, с минимальным требованием 10 объектов (ячеек) на поле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество оцененных месторождений для каждой скважины было определено на основе окончательного количества ячеек, достигших числа 1000. Система HCS продолжает поиск в различных местах в скважине до тех пор, пока не получит целевую популяцию в 1000 клеток на лунку. Таким образом, скорость сбора данных зависит от слияния и общего количества ячеек, присутствующих в каждой лунке 96-луночной пластины. В соответствии с текущим протоколом, общая и средняя интенсивность канала 2 (представляющая собой супероксидные радикалы и общую добычу АФК) была собрана из каждой скважины для дальнейшего анализа.
  5. Захват, обработка и анализ изображений
    1. После настройки и окончательной настройки параметров получения изображения запустите процесс сканирования для каждой 96-луночной пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система визуализации Cellomics CX7 обеспечивает скрининг с высоким содержанием и автоматизированный анализ образцов по различным параметрам, включая производство АФК в клетках с высокой пропускной способностью. В дополнение к производству АФК, система HCS способна предоставить дополнительную ценную информацию о различных параметрах, таких как морфология клеток, субклеточная локализация и многие другие интересующие клеточные особенности. После оптимизации для сбора данных платформа визуализации HCS позволяет проводить всестороннюю, качественную и количественную характеристику параметров клеток надежным образом.
    2. После завершения процесса сканирования запустите программное обеспечение View Analysis и экспортируйте различные количественные параметры данных в .csv формате для дополнительного анализа.
    3. Используя стороннее программное обеспечение, скопируйте и вставьте различные интересующие количественные значения для дополнительного последующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем протоколе программное обеспечение GraphPad Prism использовалось для анализа значений интенсивности DHE в ответ на индуцированный окислительный стресс, вызванный воздействиемH2O2и менадиона.
  6. Анализ данных и статистики
    1. Вычислите среднюю интенсивность канала 2 (представляющую суммарные значения АФК и супероксидные радикалы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты по расчету значений интенсивности были повторены три раза с 6 повторениями для каждого условия на каждом уровне дозирования.
    2. Выполните односторонний ANOVA или t-критерий для измерения различий в значениях интенсивности между различными условиями испытания.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Дигидроэтидий (ДГЭ) представляет собой супероксид-чувствительный флуоресцентный краситель, который предоставляет специфическую информацию о внутриклеточных состояниях АФК. Краситель DHE по своей природе излучает синюю флуоресценцию в цитоплазме. Однако при взаимодействии с суперокс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании был разработан протокол оценки внутриклеточной продукции активных форм кислорода (АФК), управляемых супероксидом, с использованием флуоресцентного красителя дигидроэтидия (ДГЭ) на системе скрининга с высоким содержанием. Большинство современных протоколов, досту...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

РК и RRG были поддержаны грантом Центра металлов в биологии и медицине UNM (CMBM) через грант NIH NIGMS P20 GM130422. RRG была поддержана пилотной премией из гранта NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Поддержка ядра визуализации для инструмента CX7 Cellomics была обеспечена через ядра центра AIM, финансируемые грантом NIH P20GM121176. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Шарину Десаи и д-ра Ли Чена за их неоценимую помощь в решении технических вопросов, связанных с использованием платформы визуализации CX7 Cellomics.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubes VWR 20170-038 
96- well plate Corning Costar 07-200-90 
Cellomics Cx7ThermoFisher HCSDCX7LEDPRO
Collagen Advanced Biomatrix  5056 
DHE (Dihydroethidium) ThermoFisher D1168 
DMEM Sigma  6046 
FBS VWR 97068-085 
GraphPad PrismGraphPadVersion 6.0
HepG2 cell lineATCC
Hoechst ThermoFisher 33342 
HUH7 cell lineATCC
Hydrogen Peroxide Sigma 88597 
JHH4 cell lineATCC
Menadione Sigma M5625 

Ссылки

  1. Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642(2021).
  2. Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
  3. Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407(2019).
  4. Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
  5. Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
  6. Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
  7. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  8. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  9. Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  10. Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
  11. Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
  12. Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
  13. Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
  14. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
  15. Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
  16. Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
  17. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  18. Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
  19. Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
  20. Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
  21. Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075(2021).
  22. Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71(2015).
  23. Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены