Использование системы перфузии тканей in vitro для обнаружения функциональной активности изолированных кишечных трубок в режиме реального времени

Резюме

Представлен метод выделения кишечных трубок крыс и оценки влияния лекарственных препаратов на их натяжение, частоту и амплитуду in vitro. Этот метод предлагает ценный подход для исследователей, изучающих кишечные трубки.

Аннотация

Желудочно-кишечные заболевания, которые имеют высокую распространенность, представляют собой значительные проблемы для человека. Тонкий кишечник является неотъемлемой частью переваривания и всасывания пищи и лекарств и играет решающую роль в лечении этих заболеваний. Эксперимент по движению кишечной трубки, распространенный и важный метод in vitro , используется для изучения динамики желудочно-кишечного тракта. Сюда входит подготовка изолированной кишечной трубки, а также суспензия подготовленной кишечной трубки в ванне и ее подключение к детектору сигналов. Затем следует запись и анализ ряда параметров, таких как напряжение, которое может быть использовано для оценки моторной функции кишечника, а также соображений по поддержанию активности кишечной трубки in vitro. Стандартизированная программа от отбора проб до сбора данных значительно улучшает повторяемость экспериментальных данных и обеспечивает достоверность регистрации напряжения кишечника после физиологического, патологического и медикаментозного вмешательства. Здесь мы представляем ключевые проблемы экспериментальной эксплуатации и ценный эталонный экспериментальный протокол для изучения лекарственных средств, регулирующих моторику желудочно-кишечного тракта.

Введение

Желудочно-кишечные заболевания, являющиеся распространенным заболеванием, оказывают серьезное воздействие на жизнь и здоровье человека¹. Расстройство моторики желудочно-кишечного тракта является важной частью функциональных заболеваний желудочно-кишечного тракта, проявляясь в первую очередь в изнурительных симптомах, задержке опорожнения желудка и серьезных проблемах с желудком². Он может нарушить координацию желудочно-кишечного тракта, затруднить опорожнение желудка, повлиять на пищевую непереносимость кишечника и даже вызвать функциональную непроходимость в тонком или толстом кишечнике³. У пациентов, перенесших операцию на желудочно-кишечном тракте, это расстройство может напрямую привести к кишечной недостаточности. Более того, кишечные расстройства связаны не только с заболеваниями желудочно-кишечного тракта, но и с патогенными факторами различных других заболеваний, таких как гепатит и заболевания центральной нервной системы. Кишечные микробные сообщества играют решающую регуляторную роль в физиологии кишечника, включая моторику, которая впоследствии влияет на колонизацию в микробной экосистеме⁴. По мере того, как вирусная инфекция гепатита В прогрессирует до хронического гепатита В, в кишечной флоре происходят изменения различной степени. Модуляция кишечной флоры продемонстрировала свои преимущества в лечении вируса гепатита В⁵. Кроме того, центральная нервная система может влиять на кишечник и изменять его микробный состав. Последние достижения в области технологии секвенирования микрофлоры выявили двунаправленные взаимодействия между микрофлорой кишечника и функцией центральной нервной системы, тесно связанные с возникновением и прогрессированием заболеваний центральной нервной системы ^6,7.

Со старением общества частота расстройств моторики желудочно-кишечного тракта растет, что связано со снижением или потерей функции нейронов в энтеральной нервной системе и внутренней иннервации кишечника⁸. По мере того, как наше понимание желудочно-кишечных заболеваний расширяется, появляются многочисленные новые идеи и подходы, которые потенциально могут привести к разработке новых лекарств. Тем не менее, многие из этих идей все еще являются гипотетическими или ожидают положительных результатов клинических испытаний, чтобы материализоваться ^9,10. Эффективные методы исследования имеют решающее значение в преодолении желудочно-кишечных заболеваний. В последние годы обширные исследования были сосредоточены на желудочно-кишечных препаратах и регуляции моторики. Желудочно-кишечные препараты и динамика желудочно-кишечного тракта неотделимы друг от друга, и многие другие системные препараты по-разному влияют на динамику желудочно-кишечного тракта. Например, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) используются при боли и воспалении, а также при замедлении желудочно-кишечного тракта, повышая^{риск развития} язвенной болезни. С другой стороны, некоторые антидепрессанты могут влиять на моторику желудочно-кишечного тракта¹². В настоящее время основным фармакологическим экспериментом in vitro, изучающим влияние желудочно-кишечных препаратов и других системных препаратов на моторику желудочно-кишечного тракта, является анализ движения кишечника in vitro ¹³. Моделируя физиологические условия, они наблюдают прямое влияние лекарств на сокращение и расслабление гладкой мускулатуры кишечника, оценивая их желудочно-кишечное воздействие. Тем не менее, точная причина нарушений моторики желудочно-кишечного тракта остается неясной, вероятно, это сложное взаимодействие генетических, экологических, диетических и нейроэндокринных факторов. Следовательно, лечение нарушений моторики желудочно-кишечного тракта продолжает представлять значительные трудности.

Тонкая кишка, являясь важным местом для пищеварения, всасывания и метаболизма лекарств, играет важную роль в работе желудочно-кишечного тракта. В результате тест на изолированное движение кишечной трубки является важным инструментом для изучения заболеваний желудочно-кишечного тракта. Это включает в себя подготовку и помещение изолированной кишечной трубки животного в ванну, подключение ее к энергообменнику, использование преобразователя для преобразования механических движений в электрические сигналы для усиления и запись с помощью физиологического регистратора. Различные параметры, такие как частота, средняя амплитуда вибрации, напряжение и площадь под кривой, могут быть измерены для оценки моторной функции кишечной трубки. Этот метод обладает такими преимуществами, как простота, экономическая целесообразность, легкость управления экспериментальными условиями, минимальные факторы влияния, высокая воспроизводимость, а также точные и надежные результаты. Более того, он особенно полезен для исследования механизма действия препарата. Тем не менее, существуют заметные проблемы в проведении эксперимента с изолированной кишечной трубкой, например, активность кишечника трудно поддерживать в течение длительного времени. Чтобы решить эти вопросы и опираться на опыт экспериментов in vitro , в данной статье будет представлено подробное введение в ключевые проблемы экспериментальной эксплуатации и представлен ценный справочный экспериментальный протокол для изучения препаратов, регулирующих моторику желудочно-кишечного тракта.

протокол

Этот протокол основан на ранее опубликованной литературе 14,15,16,17. Для настоящего исследования использовались самцы крыс Sprague Dawley (SD) (260-300 г, возраст 8-10 недель). Протокол для животных был рассмотрен и одобрен Управляющим комитетом Университета традиционной китайской медицины в Чэнду (запись No 2023017). Перед началом эксперимента крысам было поручено голодать в течение 24 часов. Во время эксперимента крысы содержались в камере для животных и имели свободный доступ к пище и воде.

1. Приготовление раствора

1. Готовят физиологический раствор соли (ПСС), содержащий 118 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl₂, 1,2 мМ KH₂PO₄, 1,2 мМ MgCl₂∙6H₂O, 25 мМ NaHCO₃, 11 мМ D-глюкозу и 5 мМ HEPES (см. таблицу материалов).
2. Насытите растворы и забарщируйте смешанным газом с содержанием 95%_O2 и 5%_CO2. Между тем, поддерживайте значения pH раствора в диапазоне от 7,38 до 7,42 с 2 мМ NaOH.
3. Предварительно охладите 1/3 PSS до 4 °C и разогрейте оставшуюся часть до 37 °C для последующих экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПСС изначально готовился при комнатной температуре на этапах 1.1-1.2

2. Диссекция кишечного канала крысы

1. Соберите чашки Петри, наполненные 4°C PSS, хирургическим пинцетом и ножницами. Введите 2% изофлуран для обезболивания крысы через ингаляцию в течение примерно 5 минут. Убедитесь, что крыса глубоко обезболивалась, проведя тест на щипки пальцев ног. При необходимости ввести дополнительные анестетики. Далее обнажают кишечный канал, открыв брюшную полость на операционном столе.
2. Быстро поместите желудочные и кишечные трубки в чашку Петри, наполненную 4 °C PSS (pH 7,40) с насыщенными 95%_O2 и 5%_CO2 . Найдите двенадцатиперстную кишку, которая является началом тонкой кишки, в привратнике желудка. С помощью пинцета аккуратно приподнимите прилегающую ткань и аккуратно отрежьте ее ножницами от края кишечника. Впоследствии разделить кишечник на сегменты по 1-2 см; Весь этот процесс проиллюстрирован на рисунке 1.

3. Суспензия и фиксация кишечного канала (рисунок 2)

1. Включите систему перфузии тканей in vitro и отрегулируйте температуру ванны в инструменте до 37 °C. Поместите PSS (37 °C) в ванну.
2. Подготовьте хирургический шов диаметром 15 см (см. Таблицу материалов) и замочите его в 4 °C PSS, который пропитан 95%_O2 + 5% CO2. С помощью шва закрепите один конец кишечного канала и используйте стальной крючок для иглы, чтобы закрепить другой конец.
3. Установите кишечный зонд. Закрепите сегмент со стальным игольчатым крючком на дне ванны и прикрепите другой конец хирургической линии к датчику. Включите газовый выключатель, чтобы в ванне появились пузырьки.
4. Откройте программное обеспечение для сбора данных (см. Таблицу материалов) и нажмите кнопку «Пуск», чтобы убедиться, что регистрируется сигнал соответствующего пути.

4. Нормализация

1. Поверните спиральную ось ванны против часовой стрелки, чтобы расслабить кишечные трубки до их естественного состояния. Нажмите Setup-Zero All Inputs, чтобы убедиться, что начальное напряжение кишечной трубки установлено в программном обеспечении на 0 g .
2. Поверните спиральную ось ванны против часовой стрелки, чтобы потянуть значение натяжения до 1 g и стабилизировать его в pH = 7,40, 95% O₂ + 5% CO₂ насыщенном 37 °C PSS в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация работы кишечного зонда заключается в приведении его предварительной нагрузки в оптимальное состояние. Для образцов из полостей была необходима оптимальная предварительная нагрузка для поддержания исключительной активности in vitro. Оптимальная предварительная нагрузка кишечного зонда крысы составляла 1 г¹⁸.

5. Обнаружение реакционной способности

1. Наблюдайте за ритмичными волнами спонтанного сокращения в программном обеспечении и переходите к следующему эксперименту, так как это указывает на достаточную реакцию.

6. Экспериментальное наблюдение

1. Добавьте исследуемый препарат (например, ацетилхолин и др.) в ванну для изучения влияния препарата на функцию кишечного зонда.
   Примечание: Эффект препарата оценивали путем сравнения изменений кривой сужения кишечника до и после введения. Когда препарат добавлен, целесообразно увеличить пузырь для смешивания препарата, а затем отрегулировать пузырь до нормального состояния после смешивания.

7. Анализ данных

Примечание: Тканевая перфузионная система in vitro имеет четыре канала, которые могут одновременно проводить тесты на воздействие четырех идентичных или разных препаратов на четыре кишечные трубки. Так как экспериментальные параметры и методы анализа одинаковы для всех каналов, в качестве примера для анализа данных выбран один канал.

1. Остановите программное обеспечение для сбора данных и выполните анализ данных с помощью этого программного обеспечения для сбора данных. Отредактируйте табло данных и выберите параметры анализа следующим образом: Нажмите на Окно-Планшет и выберите среднее напряжение для канала.
2. Выберите кривую сжатия перед введением и нажмите Добавить на Датапад; выберите кривую сокращения после введения и нажмите кнопку Добавить на планшет. Среднее значение натяжения до и после введения будет отображаться на планшете по очереди.
3. Нажмите на Window-Data Pad , чтобы скопировать данные в другое программное обеспечение для статистического анализа (см. Таблицу материалов) для статистического анализа.
4. Проанализируйте другие параметры, такие как средняя амплитуда, средняя частота и интеграл (площадь под кривой), просто замените среднее напряжение на соответствующий параметр, и операция будет такой же, как шаги 6.1-6.3.
5. Сохранить кривую сокращения: Выберите кривую сокращения, нажмите «Редактировать-Копировать данные Labchart», чтобы скопировать данные в программное обеспечение для рисования (см. Таблицу материалов), чтобы нарисовать кривую сокращения.

8. Послеоперационное лечение

1. После операции усыпьте животных в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами.
   Примечание: В настоящем исследовании животных усыпляли путем вдыхания избытка изофлурана.

Результаты

Первая часть исследования посвящена процессу отделения изолированных кишечных трубок от организма и преобразования их в 2-сантиметровые трубки in vitro. Этот процесс подробно проиллюстрирован на рисунке 1. Вторая часть включает в себя суспензию и ст...

Обсуждение

Моторика желудочно-кишечного тракта достигается серией точно скоординированных сокращений и расслаблений гладких мышц. Этот процесс включает в себя ритмичное сокращение одной группы мышечных групп, скоординированное сокращение нескольких групп и специальное проп...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma, USA	A6625
atropine	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	IA06501
Barium chloride	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
drawing software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Epinephrine	Sigma, USA	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
In vitro tissue perfusion system	PowerLab, ADInstruments, Australia	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
nifedipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	N5087
statistical analysis software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Surgical sutures	Johnson, USA	—