JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен новый подход к двухфотонной микроскопии доставки из опухоли флуоресцентно-меченых наночастиц оксида железа в глиобластому на мышиной модели.

Аннотация

Внутривенное введение противораковых препаратов к опухолям головного мозга ограничено гематоэнцефалическим барьером. Метод прямой визуализации накопления и распределения макромолекул в опухолях головного мозга in vivo значительно расширит нашу способность понимать и оптимизировать доставку лекарств в доклинических моделях. Этот протокол описывает метод отслеживания in vivo в режиме реального времени внутривенно введенных флуоресцентно меченных наночастиц с помощью двухфотонной прижизненной микроскопии (2P-IVM) на мышиной модели глиобластомы (GBM).

Протокол содержит многоступенчатое описание процедуры, включающее анестезию и анальгезию экспериментальных животных, создание краниального окна, имплантацию клеток GBM, установку планки на голову, проведение исследований 2P-IVM и послеоперационный уход для долгосрочных последующих исследований. Мы покажем репрезентативные сеансы визуализации 2P-IVM и анализ изображений, рассмотрим преимущества и недостатки этой технологии, а также обсудим потенциальные области применения.

Этот метод может быть легко модифицирован и адаптирован для различных исследовательских задач в области доклинической визуализации головного мозга in vivo .

Введение

Двухфотонная прижизненная микроскопия (2P-IVM) — это метод флуоресцентной визуализации, который позволяет визуализировать живую ткань1.

Впервые разработанный в 1990-х годах, метод 2P-IVM использовался для анализа in vivo сетчатки2, почки3, тонкой кишки4, улитки5, сердца6, трахеи7 и головного мозга в различных доклинических моделях 8,9. В области неврологии 2P-IVM приобрел важное значение как метод визуализации здорового мозга в режиме реального времени у бодрствующих животных10, а также для изучения заболеваний нервной системы, таких как болезнь Альцгеймера11, болезнь Паркинсона12 и глиобластома (GBM)13,14,15,16.

2P-IVM предлагает элегантное решение для изучения микроокружения опухоли в процессе развития ГБМ. В то время как некоторые предыдущие исследования были сосредоточены на моделях in vitro17 и ex vivo 18, другие использовали ортотопическиемодели 19 и ксенотропныемодели 20 in vivo для изучения GBM. Madden et al. провели нативную визуализацию клеточной линии глиомы крысы CNS-1 на мышиной модели13. Используя ортотопическую мышиную модель GL261-DsRed, Ricard et al. выполнили внутривенное введение флуорофора для улучшения кровеносных сосудов в области опухоли в 2P-IVM14.

Здесь мы применяем 2P-IVM для отслеживания доставки в опухоль флуоресцентно меченных наночастиц оксида железа (NP) в ортотопической мышиной модели GBM. Используя краниальное окно, этот метод позволяет детально изучить пространственно-временное распределение НЧ в головном мозге в режиме реального времени.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Процедура содержания животных, описанная в этом протоколе, соответствует требованиям Административной группы по уходу за лабораторными животными (APLAC).

1. Клеточная культура

  1. Подготовка вытяжки
    1. Вымойте руки, наденьте перчатки и лабораторный халат. Включите шкаф биологической безопасности и установите уровень створки на соответствующую высоту открывания. Дайте вытяжке продуться в течение 3-5 минут. Опрыскайте область капюшона 70% этиловым спиртом и протрите папиросной бумагой.
    2. Опрыскайте все реагенты 70% этиловым спиртом и протрите папиросной бумагой. Переместите реагенты в колпак. Не кладите на гриль какие-либо предметы. Если в вытяжке произошел разлив, накройте его салфетками, опрыскайте 70% этиловым спиртом и снова протрите.
    3. После эксперимента аккуратно закройте крышки каждого предмета, протрите все материалы, выньте все предметы из вытяжки и перенесите их на прежнее место. Распылите 70% этанол в вытяжку и протрите ее. Закройте створку и выключите шкаф биологической безопасности.
  2. Приготовление питательной среды
    1. Добавьте 50 мл 100% фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 500 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco. Добавьте 5 мл раствора антибиотика-антимикотика (100х).
    2. Пропустите все реагенты через стерильный фильтрующий флакон объемом 500 мл (фильтр 0,22 мкм).
  3. Размораживание криоконсервированных клеток
    1. В ламинарном колпаке добавьте 20 мл питательной среды в колбу T75. Пометьте колбу с названием клеток, датой и номером прохода на колбе. В данном исследовании использовались адгезивные клетки глиомы С6.
    2. Быстро разморозьте клетки на водяной бане с температурой 37 °C. Не вихряйте клетки. Разморозьте и сразу используйте ячейки.
    3. Переложите размороженные клетки в колбу T75 с помощью наконечника для пипетки объемом 1 мл. Будьте осторожны, чтобы не допустить образования пузырьков в процессе перекладки, и избегайте остатков среды в горлышке колбы. Это может увеличить риск возможного заражения.
  4. Смена носителя
    1. Смените среду на следующий день после размораживания, чтобы удалить остаточный трипсин или диметилсульфоксид (ДМСО) (шаг 1.6). После этого меняйте носитель не реже двух раз в неделю или чаще, в зависимости от уровня слияния клеток. Среду необходимо сменить через сутки после прохождения для выведения трипсина.
    2. Чтобы сменить среду, включите аспирационный аппарат, присоедините аспирационную стеклянную пипетку и аспирируйте всю среду.
    3. Добавьте 20 мл питательной среды (шаг 1.2).
  5. Проход по клеткам
    1. Загрузите вытяжку предметами, необходимыми в ходе эксперимента.
    2. Используйте аспирационную стеклянную пипетку и отсасывайте все среды, убедившись, что стеклянная пипетка находится на неячеистой стороне колбы. Для этого шага расположите колбу T75 вертикально.
    3. Добавьте ~10 мл фосфатно-солевого буфера комнатной температуры (PBS, Ca++ и Mg++) или сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS, Ca++ и Mg++ ) на неклеточной стороне. Кратковременно промойте ячейки с помощью PBS, расположив колбу T75 горизонтально стороной ячейки вниз.
    4. Сразу же поместите колбу вертикально и аспирируйте PBS/HBSS. Повторите эту промывание и аспирацию 3 раза.
    5. Добавьте 2 мл трипсина (рекомбинантного или животного происхождения) на сторону клетки (колба T75 горизонтальная, клеточная сторона вниз). Инкубируют в стандартном инкубаторе для тканевых культур (37 °C, 5% CO2) в течение 4 мин. Разотрите его один раз через 2 минуты с помощью пипетки объемом 5 мл.
    6. Через 4 мин общей инкубации перелейте раствор в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте в коническую пробирку 8 мл раствора для роста (2 мл трипсинизированных клеток + 8 мл среды = 10 мл в сумме).
    7. Используйте другую пустую коническую пробирку объемом 15 мл с фильтром и перенесите клетки через пипетку объемом 25 мл для получения отдельных клеток.
    8. Переносят 1/10 (1 мл) раствора (ячейка + среда + Tryp-LE) в колбу Т75 с 20 мл среды. В качестве альтернативы подсчитайте количество клеток (шаг 1.7). Замените носитель на следующий день, чтобы получить раствор среды, не содержащей трипсина.
  6. Замораживание среды и клеток
    1. Разморозьте 100% FBS в холодильнике с температурой 4 °C. Не используйте водяную баню или тепло, так как это может повредить белки в FBS.
    2. Для приготовления 50 мл замораживающей среды смешайте 45 мл DMEM, 5 мл FBS и 5 мл DMSO. Распределите его по 1-2 мл контейнеров, чтобы предотвратить прерывистое размораживание и повреждение белка. Храните их в морозильной камере при температуре -20° или -80°C.
    3. На оставшиеся 9 мл раствора (шаг 1,5) добавьте 1 мл среды, чтобы в сумме получить 10 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 4 мин.
    4. Удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать в 1 мл замораживающей среды (см. выше). Поместите клетки в морозильную камеру с температурой -80 °C. Переместите клетки в жидкость N2 для длительного хранения через 1 или 2 суток.
  7. Подсчет клеток
    1. Для оставшихся 9 мл (шаг 1,5) добавьте 1 мл среды, чтобы в сумме получить 10 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 4 мин.
    2. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 4 мл HBSS. Ресуспендант 10 мкл клеток в 80 мкл HBSS + 10 мкл 0,4% трипанового синего, коэффициент разбавления = 10.
    3. Возьмите 17 мкл раствора и отсчитайте четыре квадрата 4 х 4 в гемоцитометре. Среднее значение подсчитывают для четырех квадратов 4 х 4 и умножают на 104х коэффициент разбавления, чтобы получить клетки/мл.

2. Хирургическое вмешательство

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить операцию двумя исследователями, один из которых отвечает за подготовку клеток, смешивание стоматологического цемента и общую помощь в процедуре, в то время как второй человек сосредотачивается на поддержании стерильности. Наличие второго манипулятора для помощи при хирургической процедуре значительно снижает вероятность возникновения загрязнения. Следование передовым хирургическим практикам снизит вероятность послеоперационных осложнений. На рисунке 1А представлен обзор компонентов краниального окна.

  1. Общая подготовка
    1. Прежде чем начать, убедитесь, что процедура одобрена местными рекомендациями по защите животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались 5-месячные самки мышей NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5).
    2. Перед операцией автоклавируйте все хирургические инструменты и убедитесь, что все необходимые принадлежности доступны. Распечатайте записи об анестезии и операции.
    3. Убедитесь, что по прибытии у животных есть не менее 1 недели на акклиматизацию в помещении животноводства, чтобы уменьшить дополнительный послеоперационный стресс.
    4. В день операции убедитесь, что все приборы (микроскоп, грелка, стерилизатор, бормашина, вакуум и т.д.) готовы к использованию. Убедитесь, что наркозный аппарат содержит достаточное количество изофлурана, и при необходимости долейте его. Для новых пользователей процедура краниального окна может занять до 2 часов на одно животное; Поэтому наличие достаточного количества изофлурана имеет решающее значение.
    5. Поместите стеклянные окна и головные решетки в спирт и подготовьте емкость с физраствором. Это обеспечит бесперебойный рабочий процесс без каких-либо серьезных нарушений стерильности и позволит максимально сократить время нахождения под наркозом для каждого животного.
    6. Вскрыть все хирургические материалы на стерильной поверхности на рабочем месте. Например, для этой цели можно использовать внутреннюю часть стерильной марлевой упаковки. Используйте технику только наконечников. Если хирургические инструменты не используются, положите наконечники на стерильную поверхность, например, на внутреннюю часть упаковки стерильной марли.
    7. При выполнении нескольких операций поместите все хирургические инструменты в стерилизатор между операциями, чтобы продезинфицировать их. При проведении операций более чем на 5 животных используйте новый набор автоклавных инструментов. Замените наконечник сверла, когда он затупится, на новый, чтобы избежать травмирования тканей.
  2. Анестезия и подготовка к операции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка анестезии идентична как для операции, так и для визуализации.
    1. Обезболивайте мышь изофлураном (3%-5% для индукции) в анестезиологической камере. После обеспечения достаточной глубины анестезии путем проверки рефлекса отвода педали (защемление подушечки лапы на обеих задних лапах) переведите животное на подготовительную рабочую станцию. Поддерживайте анестезию над носовым конусом (1%-2%). Здесь нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить повреждение роговицы. Регулярно контролируйте потерю рефлексов во время операции, проверяя рефлекс лапы.
    2. Если требуется идентификация животного, используйте инструмент для прокалывания ушей или ножницы, чтобы отметить уши, или используйте маркер, чтобы отметить хвост.
    3. Удалите шерсть, покрывающую череп между ушами и глазами, с помощью крема для депиляции. Оставьте крем на срок, указанный производителем (30-60 с), чтобы избежать раздражения кожи. Следите за тем, чтобы крем соприкасался с корнями волос, нанося его против направления роста волос. Избегайте попадания крема для депиляции в глаза. Удалите остатки крема и волос, очистив область солевым раствором. В качестве альтернативы можно использовать машинки для стрижки.
    4. Чтобы избежать интра- и послеоперационной боли, инфекции или отека, назначайте нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), опиоиды, противовоспалительные средства и антибиотики. Перед операцией назначают карпрофен (5-20 мг/кг, подкожно), бупренорфин с пролонгированным высвобождением (1 мг/кг SQ), цефазолин (20 мг/кг SQ) и дексаметазон (0,2 мг/кг SQ). Введите примерно 0,3 мл 0,9% физиологического раствора, чтобы избежать обезвоживания.
    5. Затем потрите эту область, поочередно протирая повидон-йод и изопропиловый спирт три раза круговыми движениями от середины черепа к периферии.
  3. Процедура трепанации черепа
    1. Переложите животное на операционный стол и поместите его в вентральном положении лежа на грелку (~37 °C), чтобы обеспечить изотермические условия во время процедуры. Гипотермия у грызунов значительно снижает показатели выживаемости и продлевает фазу послеоперационного восстановления.
    2. Поместите голову в стереотаксическую рамку, расположив амбушюры и резцы. Для ушных дуг найдите скуловую дугу и вставьте стержни за дугами. Начните с фиксации контралатеральной перекладины доминирующей рукой (например, закрепите левую перекладину правой рукой, если вы правша), а затем закрепите противоположную сторону. Отрегулируйте положение ушной и резцовой планок, при необходимости повернув винты.
    3. При необходимости повторно нанесите мазь для глаз и используйте кусочек алюминиевой фольги, чтобы закрыть глаза. Это предотвратит любые повреждения, вызванные ярким светом микроскопа и ультрафиолетовым светом, используемым для последующего отверждения цианоакрилатного клея (шаг 2.5).
    4. Перед разрезом еще раз проверьте наличие рефлекса защемления пальцев ног; При необходимости соответствующим образом скорректируйте анестезию. Подключите животное к устройству мониторинга анестезии, расположив датчик на задней лапе. Измерение частоты сердечных сокращений и концентрации кислорода в крови поможет снизить смертность и улучшить послеоперационное восстановление. Кроме того, измерьте частоту дыхания, визуально изучив движение грудной клетки.
    5. Накройте тело животного простыней, чтобы избежать переохлаждения и загрязнения. Перед началом операции проведите последний мазок с повидон-йодом.
    6. Наденьте перчатки и чистый лабораторный халат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование стерильных перчаток рекомендуется из-за инвазивности процедуры и для снижения риска любой послеоперационной инфекции и воспаления, приводящих к заболеваемости и потере качества изображения в 2P-IVM (раздел 5).
    7. Поднимите кожу на черепе и сделайте разрез, удерживая ножницы между правым глазом и ухом и разрезая по направлению к левой стороне черепа, следуя следам разреза. Удалите получившийся круглый кожный лоскут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от интересующей области мозга и размера окна место разреза и диаметр могут варьироваться. Размер разреза должен быть больше диаметра головки, чтобы вместить место для монтажа (шаг 2.5). При необходимости кожу вокруг разреза можно аккуратно рассечь, чтобы освободить больше места.
    8. Удалите надкостницу, осторожно поцарапав поверхность черепа лезвием скальпеля или микрокарреткой. Соблюдайте осторожность при удалении надкостницы вокруг черепных швов, так как эти участки хрупкие и более склонны к кровотечению. Используйте физиологический раствор и пылесос, чтобы очистить операционную область от мусора. Поцарапайте надкостницу, чтобы обеспечить лучшее сцепление с цианоакрилатным клеем и стоматологическим цементом (шаг 2.5)
    9. Определите область мозга для выполнения клеточной инъекции. Для этого воспользуйтесь атласом стереотаксических координат мозга мыши. В соответствии с координатами мозга отметьте положение краниального окна с помощью биопсийного перфоратора того же диаметра, что и окно, хирургической ручки или автоклавного карандаша.
    10. Держите дрель в доминирующей руке, а любой другой инструмент (шприц, щипцы) в недоминантной руке. Избегайте длительного сверления в одном и том же месте. Дрель следует использовать очередями, чтобы избежать перегрева. Во время этих перерывов наносите на кальварию холодный физиологический раствор, чтобы сохранить операционный вид чистым и предотвратить перегрев. Используйте сенсорную обратную связь от наконечника сверла, чтобы определить, когда череп был полностью перфорирован.
    11. Используйте холодный физраствор в сочетании с пылесосом для очистки поверхности черепа. Не используйте марлю или аппликатор с ватным наконечником после вскрытия кальварии, так как остатки хлопчатобумажных нитей могут привести к реакции инородного тела при закрытии окна мозга.
    12. Во время сверления следите за тем, чтобы траектория и диаметр были того же размера, что и у стеклянного покровного стекла. Сделайте это, поместив стеклянный покровный листок на верхнюю часть черепа и убедившись, что стеклянный покровный лист точно поместится внутри черепного окна.
    13. После того, как удастся ослабить лоскут черепа, осторожно надавливая на него, с помощью щипцов осторожно извлеките фрагмент из операционного поля (рис. 1Б, слева). Если пока нет возможности надавить на череп, продолжайте сверление в тех областях черепного окна, которые все еще соединены с остальной частью черепа, и повторите оценку.
    14. При незначительном кровотечении используйте гемостатическую губку в сочетании с легким надавливанием или, в качестве альтернативы, ледяной физиологический раствор, чтобы уменьшить кровопотерю.
  4. Клеточная имплантация
    1. Подготовьте и подсчитайте имплантируемые клетки, как описано в пункте 1.7. Убедитесь, что количество клеток составляет 200 000 клеток/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подвешивать клетки в мембранном матриксе, который затвердевает при РТ. Это улучшит вероятность успеха имплантированных клеток в паренхиме головного мозга.
    2. Перенесите клетки в контейнере со льдом в операционную. Используйте газонепроницаемый микролитровый шприц. Перед аспирацией держите шприц на льду, чтобы избежать перепадов температур.
    3. После аспирации 1 мкл поместите шприц внутрь стереотаксической рамки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экономии времени можно использовать автоматическое стереотаксическое координатное устройство, показывающее положения по осям X, Y и Z. Также есть возможность вручную рассчитать позиции на основе лямбды. Не рекомендуется вводить более 1,5 мкл. Это гарантирует, что вводимая область не переполнится, что приведет к неудачной имплантации, росту за пределы паренхимы головного мозга или метастазам.
    4. Проводят имплантацию в область V2MM (зрительная кора 2, медиомедиальная часть) головного мозга, которая соответствует примерно медиально-латеральным координатам (M-L): от -1,2 до -1,6 мм, и дорсальным и вентральным (D-V): от -2,6 до -3,5 мм.
      1. Для двухфотонной визуализации (шаг 4.6) имплантируйте клетки в поверхностные области мозга, чтобы позже можно было визуализировать опухолевую массу через краниальное окно. Вводят 0,5 мкл (100 000 клеток) спереди и сзади (A-P): глубина 0,8 мм. Медленно и ступенчато перемещают иглу при входе в мозг и ждут 30 с после инъекции (рис. 1Б, средняя колонка).
      2. Используйте тот же подход при втягивании иглы и выходе из мозговой ткани. Избегайте инъекций близко к желудочкам, так как спинномозговая жидкость может способствовать метастазированию в центральной и периферической нервной системе.
  5. Закрытие краниального окна
    1. Переместите изголовье и стеклянный покровный стекло из спирта в солевой раствор. Используйте вакуумный наконечник или щипцы, чтобы переместить эти компоненты к месту операции.
    2. Поместите стеклянную покровную пластину внутрь краниального окна и поместите небольшое количество цианоакрилатного клея между черепом и стеклянным покровным стеклом. УФ-активированный цианоакрилатный клей сокращает время отверждения и позволяет избежать случайного смещения. Если клей пролился на стеклянное покрытие, удалите его с помощью аппликатора с ватным наконечником или осторожно соскребите его тупой стороной скальпеля до полного затвердевания.
      ВНИМАНИЕ: Ультрафиолетовое излучение вредно для глаз и кожи. Избегайте попадания в глаза и на кожу во время отверждения клея.
    3. Закрепив стеклозащитное стекло в краниальном окне, приложите планку для головы. Смешайте двухкомпонентный стоматологический цемент, расположите головной стержень и нанесите цемент на окружающую область, обеспечив контакт между черепом и головным стержнем. Тщательно очистите излишки цемента кончиком шприца, скальпеля или сверла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоматологический цемент очень быстро затвердевает, поэтому рекомендуется своевременно его наносить.
    4. После герметизации краниального окна определите, открыты ли какие-либо участки черепа между зубным цементом и кожей. Если это так, нанесите хирургический клей, чтобы скрыть череп, закрыв кожу. В качестве альтернативы можно наложить одинарный шов рассасывающимся шовным материалом.

3. Послеоперационное восстановление и рост опухоли

  1. Выздоровление
    1. Наблюдайте за животным на грелке в клетке для восстановления, пока оно не придет в сознание. После операции животные содержатся отдельно, чтобы снизить риск получения травмы.
    2. Назначьте восстановительную диету, например, коммерчески доступные водные гели с электролитами или сахарами. В качестве альтернативы поставляйте увлажненный стандартный лабораторный корм, чтобы обеспечить легкое питание и избежать обезвоживания и гипогликемии.
  2. Контроль
    1. После выздоровления ежедневно наблюдайте за животным на предмет признаков боли, стресса или инфекции. При необходимости введите анальгетики, противовоспалительные препараты или антибиотики. Если животное достигло конечной точки исследования, усыпите его гуманно. После заключительного сеанса визуализации мышь усыпляют путем удушья углекислым газом с последующим вывихом шейки матки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры критериев ранней эвтаназии включают, помимо прочего, значительную потерю веса (>20%), неврологические расстройства, одышку, чрезмерное кровотечение во время операции или выраженное стереотипное поведение. Осмотрите краниальное окно и при необходимости очистите его физиологическим раствором или спиртом.
    2. Чтобы отслеживать рост опухоли и планировать временные точки визуализации, выполняйте биолюминесцентную визуализацию всего тела (BLI). Для этого вводят 150 мг/кг D-люциферина внутрибрюшинно и визуализируют животное через 5-15 минут.

4. Синтез наночастиц

  1. Подготовка частиц
    1. Добавьте 11,17 мл ферумокситола (всего 6 ммоль Fe) в раствор, содержащий 50 мл 5 М NaOH, 20 мл деионизированной воды (DI-воды) и 20 мл эпихлоргидрина. Соблюдайте фазовую сегрегацию на этом этапе. Выдерживают смесь в РТ при легком встряхивании в течение 24 ч.
    2. Через 24 ч раствор становится однородным. Удалите избыток эпихлоргидрина с помощью диализной трубки (отсечка 12 000-14 000 Да) против воды в течение 3 дней.
    3. После диализа раствор, оставшийся в пробирке, переложить в стеклянную бутылку (общий объем ~110 мл). Добавьте 30 мл гидроксида аммиака и перемешивайте смесь при 37 °C в течение 18-20 ч.
    4. После перемешивания повторите диализ против воды в течение 3 дней. Раствор, оставшийся в диализной трубке, переложить в новый стеклянный флакон общим объемом ~110 мл.
  2. Конъюгация флуоресцеина изотиоцианата (FITC)
    1. Вынимают 27,5 мл амино-функционализированных частиц для конъюгации FITC. Сконцентрируйте частицы с помощью ультрацентрифугированного фильтра 10 кДа и промойте буфером pH 9 (Na2CO3 / NaHCO3) при 5752 x g при 25 °C в течение 10 минут.
    2. Добавьте 4 мл раствора в фильтр и ультрацентрифугируйте пробирку при 5752 x g при 25 °C в течение 10 минут. Выбросьте фильтрат и снова заполните фильтр буфером для второго раунда промывки по тому же протоколу.
    3. Выбросьте фильтрат и соберите раствор в фильтре с помощью пипетки. Оцените молярную концентрацию частицы по массовой концентрации Ферумокситола, предполагая, что диаметр каждой частицы составляет 5 нм.
    4. Растворите FITC в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 10 мг/мл. Медленно добавьте 1,4 мл растворенного ДМСО FITC в концентрированную аминофункционализированную частицу. Молярное соотношение FITC:частица составляет 20:1. После этого настаивают раствор при 4 °С в течение 8 ч в темноте.
    5. Погасите реакцию, добавив избытокNH3. Н2О(конечная концентрацияNH3. H2O составляет 50 мМ), затем раствор выдерживают при температуре 4 °C в темноте в течение 2 ч. Смойте излишки FITC с помощью буфера Na2CO3 / NaHCO3 (pH 9) через фильтр 10 кДа при 5752 x g при 25 °C в течение 10 мин. Окончательный рН раствора доводят до 7,4 с помощью водного раствора HCl.

5. 2П-ИВМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сеансов 2P-IVM использовался микроскоп Prairie Ultima IV со специальным столиком (рис. 2 и дополнительный файл кодирования 1), который позволяет регулировать положение краниального окна по горизонтали и вертикали. Для постобработки и анализа изображений использовалось программное обеспечение Fiji. Таким образом, лазерный луч можно настроить так, чтобы он попадал на стекло под углом 90 °, уменьшая артефакты и улучшая качество изображения.

  1. Сеанс визуализации
    1. Включите лазер Ti-Sapphire. Включите главный системный переключатель и программное обеспечение Prairie View.
    2. Обезболивайте животное, как описано выше (шаг 2.2). Проводите сеансы визуализации продолжительностью до 2 часов для каждого животного. Сведите время визуализации к минимуму, чтобы снизить риск осложнений анестезии и связанной с ними заболеваемости или смертности.
    3. Обездвижьте мышь под двухфотонным микроскопом с помощью специального столика (рис. 1B, правая колонка). Поместите животное в положение лежа на грелку, предназначенную для хирургии грызунов, и слегка закрепите ее с помощью скотча, следя за тем, чтобы грудная клетка не сжималась. Капните каплю воды на краниальное окно и отрегулируйте фокусировку.
    4. Измеряйте частоту сердечных сокращений и насыщение крови кислородом, чтобы контролировать жизненно важные параметры животных. Расположите датчик на задней лапе и держите устройство мониторинга за пределами двухфотонной камеры визуализации.
    5. Как только животное окажется на предметном столике микроскопа, отрегулируйте положение головы. С помощью бинокля и широкоугольного флуоресцентного освещения установите фильтр красного флуоресцентного белка (RFP) и найдите желаемое поле зрения изображения (рис. 1B, правый столбец).
    6. После определения ориентации образца и поля зрения переведите микроскоп из широкоугольного режима в режим световой сканирующей микроскопии (LSM).
    7. Убедитесь, что лазер Ti-Sapphire заблокирован на длине волны 920 нм, а все жалюзи открыты. Доведите напряжение детекторов с фотоумножителем GaAsP до 500-600 В. Используйте два ФЭУ с наборами фильтров с полосами пропускания 595/50 (RFP) и 525/50.
    8. Нажмите Live Image (Живое изображение) и медленно модифицируйте ячейку Пкеля, чтобы увеличить мощность лазера на образце до тех пор, пока изображение не станет видимым.
    9. После получения четкого изображения используйте программное обеспечение и моторизованный столик, чтобы установить верхнюю и нижнюю часть стека изображений в пределах требуемой области образца. Обратите внимание на размер шага и примите во внимание, что ось Z регулирует глубину линзы.
    10. С увеличением глубины изображения будут становиться темнее. Медленно увеличивайте усиление pockels/PMT, чтобы изображение оставалось ярким. Будьте осторожны и не используйте слишком много энергии, так как это может привести к фототоксичности и повреждению тканей.
    11. Задайте путь сохранения и запустите серию Z. Он автоматически перейдет в начальную и конечную позиции, используя установленные настройки pockel/PMT. После завершения стека используйте воспроизведение, чтобы проверить его качество на предмет качества. Как только получение необходимых изображений будет завершено, выключите лазер Ti-Sapphire.
    12. Переместите животное в клетку для восстановления, как описано выше (шаг 3.1).
    13. Выйдите из представления Prairie и убедитесь, что все данные сохранены/перенесены. Выключите компьютер и выключите все оборудование.
  2. Постобработка с FIJI
    ПРИМЕЧАНИЕ: Fiji представляет собой программное обеспечение с открытым исходным кодом, ориентированное на анализ биологических изображений21.
    1. Скачать FIJI в отношении операционной системы. Распакуйте содержимое папки и запустите .exe файл.
    2. Перетащите файл .env, собранный из двухфотонного изображения, в диалоговое окно. Разделите каналы на разные поля изображений. При этом будут созданы два разных изображения с разными каналами, одно из которых содержит сигнал клетки, а другое — сигнал частицы.
    3. Скопируйте одно из изображений и нажмите « Файл» > «Создать > внутреннем буфере обмена », чтобы создать еще одно изображение. Переименуйте одно из изображений в Источник , а другое в Копию.
    4. Используйте скопированное изображение и нажмите « Обработать» > «Повысить контрастность» в диалоговом окне. Нажмите «Нормализовать » и «ОК », а затем «Обработать > сглаживание». Это изображение используется для создания маски, а не для анализа. Нажмите на Изображение > Настроить порог > в диалоговом окне. Используйте скользящую шкалу и метод, подходящий для извлечения, затем нажмите кнопку Применить.
    5. Используйте команду «Обработать > двоичный > размытый », чтобы удалить отдельные пиксели на заднем плане, и нажмите «Обработать > двоичный > расширение », чтобы добавить обратно пиксели к изображению.
    6. Нажмите на Process > Image Calculator в диалоговом окне, выберите исходное изображение в качестве первого и выберите второе изображение в качестве Копировать. Используйте оператор AND , чтобы создать пересечение обоих изображений. Повторите тот же шаг для изображения другого канала.
    7. Для анализа сигнала за пределами сосудистой области откройте неизмененное скопированное изображение и удалите сосудистую область сигнала с помощью инструмента Freehand ROI.
    8. Установите желаемые параметры, перейдя в раздел «Анализ» > «Установить измерения». Убедитесь, что отмечены опции Площадь, Интегрированная плотность и Среднее значение серого .
    9. Теперь анализируем с помощью Analyze > Measure. Всплывет окно с измерениями. Скопируйте данные в электронную таблицу.
    10. Теперь выделите небольшую область изображения, которая не имеет флуоресценции. Это будет фоном.
    11. Щелкните Анализ > Измерить для этого региона. Скопируйте данные в электронную таблицу.
    12. Сохраните полученное изображение как Файл > Сохранить как > Анализ типа файла для повторных измерений или публикации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Здесь мы выполнили операцию на краниальном окне и приживили клетки C6 в мышиной модели GBM NSG (n = 5). Надлежащая герметизация между всеми компонентами, участвующими в создании окна (рис. 1A), обеспечит долговечность окон при длительной визуализации и, кроме того, снизит заболе?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы представляем метод отслеживания НЧ in vivo в режиме реального времени с использованием 2P-IVM через краниальное окно для оценки доставки в опухоль флуоресцентно меченных НЧ оксида железа. Хирургическая техника этой процедуры требует твердой руки и продвинутых экспериментальных хи?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Стэнфордскую службу нейробиологической микроскопии Ву Цай, Стэнфордский центр инноваций в области визуализации in vivo (SCi3) - центр визуализации мелких животных, NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, руководитель Майкл Мозли, доктор философии) и Стэнфордский центр доклинической визуализации на Портер-Драйв за предоставление оборудования и инфраструктуры для этого проекта. Эта работа была поддержана грантом Национального института детского здоровья и развития человека, грант No R01HD103638. Мы хотели бы поблагодарить Schnitzer Group, Стэнфордский университет; лаборатория Цзо, Университет Санта-Крус; и Лаборатория нейроваскулярной визуализации, Бостонский фотонный центр, Бостонский университет, для образовательных дискуссий по двухфотонной визуализации и моделям краниальных окон.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% sodium chloride infusion solutionBaxter Corp533-JB1301P

Dulbecco's Modified Eagle Medium		Invitrogen11965-092
1 mL syringesBDLuer-Lok syringe, REF309628
10% FBSThermo fisherCytiva SH30910.03HI
10% DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
2-photon microscopePrairie Technologies, BrukerPrairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%Medline Industries, LPMDS093810
Alcohol, spray bottleDecon Labs IncDecon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foilReynold BrandsReynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machinePatterson ScientificSAS3
Anesthesia monitoring Kent Scientific MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquidInvitrogen15240-096
Betadine applicatorsProfessional Disposables International, IncS41125
Biopsy punch, 5 mm MiltexSize 5
Buprenorphine sustained releaseZoo PharmBup SR Lab, 1.0 mg/mLA generic drug can be used instead. 
C6 rat glioma cell lineATCC (American Tissue Culture Collection)CCL-107
CannulasBD16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
CarprofenPfizer Rimadyl, 50 mg/mlA generic drug can be used instead. 
CefazolineSagent Pharmaceuticals25021-101-10, 1 g/vialA generic drug can be used instead. 
Cell strainer, 40 µmFisher Scientific87711
Cotton tip applicators, 6” Dyad Medical Sourcing, LLCHCS1005
Dental cementStoelting Co51459Dental cement kit, clear, 2 components
DexamethasoneBimeda138RX, 2 mg/mLA generic drug can be used instead. 
DietGelClearH2ORecovery, 72-06-502
Drape Cardinal HealthBio Shield Wrap
DrillSaeyang MicrotechEscort Pro, B08350
Drill tips Hager & Meissinger GmbHREF310104001001005Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis softwareNational Institute of Healthhttps://imagej.net/software/fiji/
ForcepsFisher Scientific13-812-41
GauzeFisher HealthCareSterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam Ethicon Inc. Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator Cellpoint Scientific Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameterFisher ScientificMenzel Cover glass 
Gloves, non-sterileFisher ScientificNitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterileMedline Industries, LPMDS104070
Hair removal creamChurch & DwightNair Hair remover lotion 
Hamilton syringeHamilton Company IncGastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, MgFisher ScientificPI88284
Head barHongway5 mm inner diameter O-rings
Heating padStoelting Co. Rodent warmer X2
Insulin syringesExel International Medical Products 29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticlesCovis Pharma GmbHFeraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
IsofluraneDechra26675-46-7
MiceJackson LaboratoriesNSG, Strain 005557
Microscope (surgery)Seiler MedicalSeiler IQ Q-100-220
NanoparticlesCustomIron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointmentMajor pharmaceuticalsLubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
OxygenLinde Gas & Equipment Inc. High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cupsGeorgia-Pacirif Consumer ProductsDixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubingBraintree Scientific50-195-5494
ScaleOhaus CorpCR2200
ScalpelIntegra Life Sciences Production CorpIntegra Miltex Stainless steel disposable scalpel
ScissorsFisher Scientific13-804-18
SealantHenkel CorpLoctite 4014
Single use lab gownHigh Tech Conversions17-444-081
Stereotactic frameStoelting Co. Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration SystemsFisher ScientificS2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam boxN/AN/A
Surgical glovesCardinal Health19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive3M Animal Care Prodcuts1469SB
Tail vein cathetherCustomConsists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing 
TrypLE Express (1x), no phenol redInvitrogen12604-039
Ultraviolett torchSpring sunshine technologyConsciot

Ссылки

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina. J Vis Exp. 168, 61970(2021).
  3. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).
  4. Jang, W. H., et al. Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice. Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).
  5. Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo. Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).
  6. Matsuura, R., et al. Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart. Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).
  7. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Sci Rep. 7 (1), 694(2017).
  8. Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
  9. Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 17 (1), (2019).
  10. Birkner, A., Konnerth, A. Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator. Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).
  11. Busche, M. A. In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models. Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).
  12. Li, L., et al. A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models. Nat Commun. 5, 3276(2014).
  13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).
  14. Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Sci Rep. 6, 26381(2016).
  15. Soubéran, A., et al. Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice. J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).
  16. Zhang, W., et al. Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model. Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).
  17. Wartchow, K. M., et al. Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy. Cells. 10 (3), 556(2021).
  18. Jiang, L. W., et al. Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy. J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).
  19. Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).
  20. Zhang, Y. S., et al. Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy. Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice. J Vis Exp. 189, 64188(2022).
  23. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  24. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Sci Rep. 6, 27818(2016).
  25. Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).
  26. Kılıç, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Front Physiol. 11, 612678(2021).
  27. Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
  28. Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).
  29. Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
  30. Xin, H., et al. Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).
  31. Valable, S., et al. In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma. Neuroimage. 40 (2), 972(2008).
  32. Jia, Y., et al. Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles. ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).
  33. Asan, L., et al. Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy. Sci Rep. 11, 4234(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены