Хроническое констрикционное повреждение дистального инфраорбитального нерва (DIoN-CCI) у мышей для изучения нейропатической боли тройничного нерва

Резюме

Хроническое сужительное повреждение дистального инфраорбитального нерва у мышей вызывает изменения спонтанного поведения (повышенная активность по уходу за лицом) и ноцифенсивного поведения в ответ на тактильную стимуляцию (гиперреактивность на стимуляцию волос фон Фрея), которые являются признаками продолжающейся боли и аллодинии, и служит моделью нейропатической боли тройничного нерва.

Аннотация

Животные модели остаются необходимыми инструментами для изучения нейропатической боли. В данной рукописи описана модель хронического констрикционного повреждения дистального инфраорбитального нерва (DIoN-CCI) для изучения нейропатической боли тройничного нерва у мышей. Это включает в себя хирургические процедуры для выполнения хронической констрикционной травмы и послеоперационные поведенческие тесты для оценки изменений в спонтанном и вызванном поведении, которые являются признаками продолжающейся боли и механической аллодинии. Методы и поведенческие показания аналогичны модели хронического повреждения инфраорбитального нерва (IoN-CCI) у крыс. Тем не менее, необходимы важные изменения для адаптации модели IoN-CCI к мышам. Во-первых, интраорбитальный доступ заменяется более ростральным доступом с разрезом между глазом и подушечкой усов. Таким образом, IoN лигируется дистально за пределами орбитальной полости. Во-вторых, из-за более высокой локомоторной активности у мышей, позволить крысам свободно передвигаться в небольших клетках заменяется помещением мышей в специально разработанные и изготовленные ограничивающие устройства. После лигирования DIoN у мышей наблюдаются изменения в спонтанном поведении и в ответ на стимуляцию волос фон Фрея, которые аналогичны таковым у крыс с IoN-CCI, т.е. повышенный направленный уход за лицом и гиперреакция на стимуляцию волос фон Фрея на территории IoN.

Введение

Нейропатическая боль возникает из-за повреждения соматосенсорной нервной системы, что приводит к аномальной передаче сенсорных сигналов в мозг. Повреждение соматосенсорных нервов не всегда приводит к нейропатической боли, но распространенность увеличивается с тяжестью клинической нейропатии ^1,2. Пациенты с нейропатической болью испытывают специфические симптомы, такие как спонтанные ощущения (жжение, покалывание, электрические ощущения) и аномально интенсивную или длительную боль при безобидной или вредной стимуляции, которая имеет тенденцию становиться хронической и устойчивой к лечению обычными обезболивающими^{препаратами.} Значительный прогресс в области исследований нейропатической боли связан с открытием того, что слабое сужение лигатур вокруг седалищного нерва у крыс приводит к поведению, напоминающему человеческие нейропатические^{болевые состояния}. Животные демонстрируют сниженные пороги к теплу, холоду и механической стимуляции, а также демонстрируют ноцифенсивное поведение. Несмотря на врожденные биологические различия в обработке боли между людьми и грызунами, животные модели являются ценным инструментом для изучения основных механизмов развития нейропатической боли и тестирования недавно предложенных стратегий лечения.

Парадигмы тестирования боли, основанные на сенсорных рефлексах, широко используются в моделях нейропатической боли, но измерение продолжающейся боли или других часто сопровождаемых нарушений (расстройство сна, депрессия, тревога) не получило достаточного внимания, учитывая, что это общие клинические симптомы, влияющие на качество жизни 5,6,7,8 . Было документально подтверждено, что поведение крыс по уходу за лицом является мерой спонтанной нейропатической боли после хронической констрикционной травмы (ЧМТ) инфраорбитального нерва (ИОН)^9,10. Кроме того, у крыс также развивается гиперреактивность на мягкую тактильную стимуляцию территории IoN, что свидетельствует о механической аллодинии.

По сравнению с мышами, из-за более крупных размеров, крысы лучше подходят для хирургических травм. Тем не менее, мыши отличаются экономичностью и эффективностью использования пространства и требуют меньшего количества лекарств. Кроме того, появление трансгенных технологий еще больше увеличило использование мышей^11,12. Таким образом, общая цель этой процедуры заключается в проведении хирургического повреждения подглазничного нерва у мышей, аналогичного тому, которое происходит у крыс, которое вызывает изменения в спонтанном и вызванном поведении для изучения нейропатической боли тройничного нерва.

протокол

Лечение и уход за животными осуществляются в соответствии с рекомендациями по исследованию боли у животных, находящихся в сознании, Международной ассоциации по изучению боли и в соответствии с Фламандскими и Европейскими правилами исследований на животных и рекомендациями ARRIVE. Протокол утверждается институциональным Этическим комитетом.

1. Животные

1. Используйте самцов и самок мышей C57BL/6J (Жанвье, 10 недель на момент прибытия).
2. Содержать самцов и самок мышей отдельно в стандартных клетках с твердым дном в помещении колонии с влажностью 40%-60% и комнатной температурой (RT) 21 ± 1 °C.
3. Обеспечьте водой и едой в неограниченном количестве.
4. Держите мышей в обычном темне/световом цикле 12:12 ч (свет включается в 08:00).

2. Хирургия

1. Для каждой мыши приготовьте один кусок хромированной кишечной лигатуры (6-0) длиной примерно 6 см и поместите его в стерильный физиологический раствор, чтобы избежать высыхания и становления жестким и ломким.
2. Обезболить мышь кетамином/ксилазином (75/15 мг/кг, внутрибрюшинно, объем инъекции 10 мл/кг). Проверьте глубину анестезии, зажав кожу между пальцами ног. Следите за тем, чтобы мышь не сгибала ногу. При необходимости дождитесь полного обезболивания животного и/или введите дополнительно кетамин/ксилазин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует назначать дополнительные анальгетики, чтобы избежать упреждающих обезболивающих эффектов, которые могут помешать развитию нейропатической боли в тройничном равноплодии.
3. Аккуратно сбрейте щечные волосы между подушечкой усов и глазом, чтобы сделать разрез примерно на 4 мм ровно до подглазничного отверстия. Следите за тем, чтобы не повредить усы, так как это может повлиять на поведенческое тестирование.
4. Зафиксируйте головку мыши в стереотаксической рамке или иным образом зафиксируйте голову. Поместите мышь на подогреваемую подушку или позаботьтесь о поддержании температуры тела в противном случае.
5. Нанесите мазь на оба глаза, чтобы избежать пересыхания. Потрите бритую область головы спиртом, а затем бетадином. Наложите хирургическую простыню, обнажающую бритую область головы.
6. Используйте микроскоп для шагов с 2.7 по 2.14.
7. Сделайте разрез кожи диаметром 4 мм перпендикулярно средней линии примерно на полпути между краем подушечки усов и глазом, прямо рострально к подглазничному отверстию и по центру линии между центром глаза и центром подушечки усов.
8. Обнажите IoN, резко отделив поверхностную соединительную ткань. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму повреждение мускулатуры и избегать двигательных нервных волокон. Убедитесь, что ствол IoN (1-1,5 мм в диаметре) доступен на глубине примерно 3 мм между местом, где он выходит из черепа, и местом, где он разветвляется к подушечке усов (Рисунок 1).
9. Вращательными движениями просуньте головку крючкового лигационного аппарата под IoN, стараясь не повредить нерв.
10. Поместите хромированную кишечную лигатуру через отверстие на кончике лигационного средства и втяните его так, чтобы лигатура оставалась под IoN и оба конца лигатуры были более или менее равноудалены от IoN.
11. Завяжите «скользящий узел» с двух концов лигатуры и проведите узлом по IoN. Убедитесь, что скользящий узел обеспечивает плавное действие, чтобы можно было точно контролировать степень сжатия. Сдвиньте узел дальше и сожмите IoN. Уменьшите диаметр нерва лишь на заметную величину⁴. Поместите обычный узел поверх разрезного узла, чтобы он не соскользнул.
12. Обрежьте концы лигатуры, оставив примерно 1,5 мм свободных концов, чтобы узел не развязался.
13. Проведите фиктивную операцию, выполнив шаги 2.2-2.8.
14. Закройте разрез кожи с помощью синтетических рассасывающихся швов (6-0) и дайте животному восстановиться на подогреваемой подушке или под инфракрасной нагревательной лампой.

3. Поведенческое тестирование

1. Акклиматизируйте мышь к условиям содержания не менее чем за 8 дней до предоперационного тестирования.
2. Перед предоперационным обследованием приучайте мышь к процедуре тестирования не реже одного раза в день в течение 3 дней.
3. Проводите тестирование в нормальных условиях освещения. При необходимости обеспечьте фоновый шум, чтобы свести к минимуму помехи от внешних шумов.
4. Наблюдение за груминговым поведением лица
   1. Переносите одну мышь из корпуса в испытательную комнату в закрытой пластиковой клетке без подстилки. Избегайте внешних раздражителей во время транспортировки животных.
   2. Поместите мышь в закрытую прозрачную пластиковую клетку без подстилки (Д x Ш x В: 12 см x 12 см x 17 см) перед видеокамерой. Установите зеркало, чтобы видеть морду животного, когда оно обращено спиной к камере.
   3. Записывайте поведение мыши в течение 10 минут. Во время записи следите за тем, чтобы экспериментатор не присутствовал в комнате.
   4. После записи очередного животного очистите смотровую клетку.
   5. Попросите наблюдателя, слепого к условиям эксперимента мыши, проанализировать записанное поведение.
   6. Обратите внимание на каждый эпизод груминга лица, анализируя 10-минутную запись. Уход за лицом — это модели движений, при которых животное приводит передние лапы в контакт с участками лица.
   7. Проводите различие между изолированным уходом за лицом и поведением по уходу за лицом во время ухода за телом⁹. Если последовательности не предшествует или за ней не следует груминг тела, эпизод обозначается как изолированный уход за лицом. Груминг тела определяется как модели движений, при которых лапы, язык или резцы соприкасаются с областью тела, отличной от морды или передних лап. Если уход за телом присутствует до или после последовательности ухода за лицом, эпизод помечается как уход за лицом во время ухода за телом.
   8. Определите количество эпизодов груминга лица, применив критерий отсечения 4 с. Промежуток времени между действиями груминга менее 4 с определяется как пауза в одном эпизоде. Период времени более 4 с определяется как полное прерывание действий по грумингу между двумя эпизодами.
5. Испытание на механическую стимуляцию
   1. Переносите мышей группами до 6 животных из корпуса в испытательное помещение в крытой клетке с подстилкой. Опять же, следите за тем, чтобы избежать внешнего раздражения.
   2. Поставьте мышей по одной на стол.
      1. Поместите хвост мыши в мягкий силиконовый зажим и прикрепите зажим с помощью магнита к металлической пластине на столе. Силиконовый материал предотвращает соскальзывание хвоста с зажима, минимизируя при этом давление на хвост.
      2. Поместите на животное пластиковый держатель с тремя стенками (65 мм x 25 мм x 23 мм) так, чтобы из контейнера выступала только голова мыши. Размер держателя позволяет совершать движения головой и передней лапой, но не позволяет животному поворачиваться внутри него. Наконец, поместите груз на верхнюю часть держателя, чтобы удерживать держатель на месте (рисунок 2).
   3. Используйте градуированный ряд из четырех волос фон Фрея. Усилие, необходимое для сгибания волосков, составляет 0,02 г, 0,16 г, 0,4 г и 1,0 г.
   4. Приучайте мышей к удерживающему устройству и дотягивающим движениям в течение 10 мин. Каждые 30 с делайте тянущее движение на каждое животное.
   5. Когда животное находится в расслабленном состоянии, медленно нанесите самые светлые волосы фон Фрея в пределах территории IoN вблизи центра вибрисс, пока волосы фон Фрея не загнутся. Следите за тем, чтобы стимуляция занимала не более 1 с.
   6. Оцените реакцию животного на стимуляцию, чтобы она была отнесена к одной из следующих категорий реакций.
      1. Поставьте оценку 0, если ответа нет.
      2. Оцените 1 балл за обнаружение, т.е. мышь поворачивает голову в сторону стимулирующего объекта, а затем исследует объект стимула.
      3. Оцените реакцию отмены 2 балла, т.е. мышь мягко отворачивает голову или быстро оттягивает ее назад при воздействии стимуляции; Иногда происходит однократное протирание лица ипсилатерально к стимулированной области.
      4. Оцените 3 балла за атаку, т.е. мышь атакует объект-стимул, совершая кусающие и/или хватающие движения.
      5. Оцените 4 балла за асимметричный уход за лицом, т.е. мышь демонстрирует непрерывную серию из как минимум трех движений для умывания лица, направленных на стимулированную область лица.
   7. Для каждой мыши нанесите волоски фон Фрея в порядке возрастания интенсивности и произвольно стимулируйте ипсилатеральную и контралатеральную стороны. Применяйте интенсивность каждого стимула по одному разу с каждой стороны.
   8. Рассчитайте средний балл по ответам на четыре волоска фон Фрея у каждого животного. Рассчитайте отдельные баллы для ипсилатеральной и контралатеральной сторон.

Результаты

Мыши DIoN-CCI демонстрируют значительное послеоперационное увеличение времени, затрачиваемого на изолированный груминг лица, и количество эпизодов изолированного груминга лица (Рисунок 3). Самое сильное увеличение происходит в течение первой послеопер?...

Обсуждение

У крыс ранее утверждалось, что интраорбитальный подход к IoN является предпочтительным, учитывая важность неповрежденной мелкой мускулатуры, контролирующей сложные паттерны взбивания в виброссотактильной дискриминации, и относительное расстояние разреза по средне?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut (6-0)	Dynek	CG602D	ligatures
Cotton applicator	Pharmacy
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Duratears	Alcon	0037-820	ophthalmic ointment
Hooked ligation aid	Fine Science Tools	18062-12
Ketalar	Pfizer		ketamine (50 mg/mL)
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Precision cotton swab	Qosina	10225
Precision trimmer	Philips	HP6392/00
Rompun	Bayer		xylazine (2%)
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011
Vicryl Rapide	Ethicon	MPVR489H	sutures