Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Этот протокол описывает анализ на основе БРЭТ для измерения взаимодействий киназы CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. В протоколе изложены шаги по подготовке ячеек, считыванию излучений BRET и анализу данных. Также представлен пример результата с идентификацией соответствующих элементов управления и устранением неполадок для оптимизации анализа.
CRAF является первичным эффектором ГТФаз RAS и играет решающую роль в онкогенезе нескольких видов рака, вызванных KRAS. Кроме того, CRAF является горячей точкой для мутаций зародышевой линии, которые, как показано, вызывают развитие RASopathy, синдром Нунан. Все RAF-киназы содержат множественные фосфорилирование-зависимые сайты связывания для 14-3-3 регуляторных белков. Дифференциальное связывание 14-3-3 с этими сайтами играет важную роль в образовании активных димеров RAF на плазматической мембране в условиях передачи сигналов и в поддержании аутоингибирования RAF в условиях покоя. Понимание того, как регулируются эти взаимодействия и как они могут быть модулированы, имеет решающее значение для определения новых терапевтических подходов, нацеленных на функцию RAF. В этой статье я опишу анализ на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. В частности, этот анализ измеряет взаимодействия CRAF, слитых с донором нанолюциферазы, и 14-3-3, слитых с акцептором метки Halo, где взаимодействие RAF и 14-3-3 приводит к передаче энергии от донора к акцептору и генерации сигнала BRET. Протокол также показывает, что этот сигнал может быть нарушен мутациями, которые, как было показано, предотвращают связывание 14-3-3 с каждым из его высокоаффинных стыковочных сайтов RAF. В этом протоколе описаны процедуры посева, трансфекции и повторного посева клеток, а также подробные инструкции по считыванию эмиссии BRET, выполнению анализа данных и подтверждению уровней экспрессии белка. Кроме того, приводятся примеры результатов анализа, а также шаги по оптимизации и устранению неполадок.
RAF-киназы (ARAF, BRAF и CRAF) являются прямыми эффекторами ГТФаз RAS и инициирующими членами каскада киназ RAF-MEK-ERK, способствующего пролиферации/выживанию. Недавние исследования показали, что экспрессия CRAF играет ключевую роль в онкогенезе нескольких видов рака, вызванных KRAS, включая немелкоклеточный рак легкого и протоковую аденокарциному поджелудочной железы 1,2,3,4,5. Кроме того, мутации зародышевой линии CRAF вызывают особенно тяжелую форму РАСопатии – синдромНунан ....
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ проводится на клетках размером 293 фута. Хорошо охарактеризованная и легко трансфицируемая эпителиальная линия, полученная из эмбриональных клеток почек человека. Одна сливающаяся 10-сантиметровая чашка для культивирования этих клеток обычно обеспечивает достаточное количество клеток для засеивания 20 лунок 6-луночных тканевых культуральных планшетов. Шаги 1-3 должны быть выполнены с использованием стерильной техники в шкафу биологической безопасности.
1. Посев клеток (день 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки отделяют от чашки (чашек) для культуры тканей, подсчитывают и засе....
При выполнении в соответствии с описанием в данном протоколе (рис. 2) взаимодействие Nano-CRAFWT и 14-3-3ζ-Halo должно привести к скорректированным соотношениям BRET 50-60 мБУ (рис. 3A; Дополнительная таблица 1). CRAF содержит два фосфорилированных 14-3-3 стыков.......
Предыдущие исследования показали, что белки 14-3-3 играют решающую роль как в активации, так и в ингибировании киназ RAF. Понимание того, как регулируются эти события связывания и влияние модуляции этих взаимодействий на передачу сигналов RAF и онкогенез, вызванный RAF, может выявить новые тер.......
Раскрывать нечего.
Этот проект был частично профинансирован за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, под номером ZIA BC 010329.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
Reagents | |||
X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
Cell lines | |||
293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
DNA vectors | |||
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
Equipment | |||
EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
Software | |||
GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
Other | |||
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены