Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает анализ на основе БРЭТ для измерения взаимодействий киназы CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. В протоколе изложены шаги по подготовке ячеек, считыванию излучений BRET и анализу данных. Также представлен пример результата с идентификацией соответствующих элементов управления и устранением неполадок для оптимизации анализа.

Аннотация

CRAF является первичным эффектором ГТФаз RAS и играет решающую роль в онкогенезе нескольких видов рака, вызванных KRAS. Кроме того, CRAF является горячей точкой для мутаций зародышевой линии, которые, как показано, вызывают развитие RASopathy, синдром Нунан. Все RAF-киназы содержат множественные фосфорилирование-зависимые сайты связывания для 14-3-3 регуляторных белков. Дифференциальное связывание 14-3-3 с этими сайтами играет важную роль в образовании активных димеров RAF на плазматической мембране в условиях передачи сигналов и в поддержании аутоингибирования RAF в условиях покоя. Понимание того, как регулируются эти взаимодействия и как они могут быть модулированы, имеет решающее значение для определения новых терапевтических подходов, нацеленных на функцию RAF. В этой статье я опишу анализ на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. В частности, этот анализ измеряет взаимодействия CRAF, слитых с донором нанолюциферазы, и 14-3-3, слитых с акцептором метки Halo, где взаимодействие RAF и 14-3-3 приводит к передаче энергии от донора к акцептору и генерации сигнала BRET. Протокол также показывает, что этот сигнал может быть нарушен мутациями, которые, как было показано, предотвращают связывание 14-3-3 с каждым из его высокоаффинных стыковочных сайтов RAF. В этом протоколе описаны процедуры посева, трансфекции и повторного посева клеток, а также подробные инструкции по считыванию эмиссии BRET, выполнению анализа данных и подтверждению уровней экспрессии белка. Кроме того, приводятся примеры результатов анализа, а также шаги по оптимизации и устранению неполадок.

Введение

RAF-киназы (ARAF, BRAF и CRAF) являются прямыми эффекторами ГТФаз RAS и инициирующими членами каскада киназ RAF-MEK-ERK, способствующего пролиферации/выживанию. Недавние исследования показали, что экспрессия CRAF играет ключевую роль в онкогенезе нескольких видов рака, вызванных KRAS, включая немелкоклеточный рак легкого и протоковую аденокарциному поджелудочной железы 1,2,3,4,5. Кроме того, мутации зародышевой линии CRAF вызывают особенно тяжелую форму РАСопатии – синдромНунан ....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ проводится на клетках размером 293 фута. Хорошо охарактеризованная и легко трансфицируемая эпителиальная линия, полученная из эмбриональных клеток почек человека. Одна сливающаяся 10-сантиметровая чашка для культивирования этих клеток обычно обеспечивает достаточное количество клеток для засеивания 20 лунок 6-луночных тканевых культуральных планшетов. Шаги 1-3 должны быть выполнены с использованием стерильной техники в шкафу биологической безопасности.

1. Посев клеток (день 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки отделяют от чашки (чашек) для культуры тканей, подсчитывают и засе....

Результаты

При выполнении в соответствии с описанием в данном протоколе (рис. 2) взаимодействие Nano-CRAFWT и 14-3-3ζ-Halo должно привести к скорректированным соотношениям BRET 50-60 мБУ (рис. 3A; Дополнительная таблица 1). CRAF содержит два фосфорилированных 14-3-3 стыков.......

Обсуждение

Предыдущие исследования показали, что белки 14-3-3 играют решающую роль как в активации, так и в ингибировании киназ RAF. Понимание того, как регулируются эти события связывания и влияние модуляции этих взаимодействий на передачу сигналов RAF и онкогенез, вызванный RAF, может выявить новые тер.......

Раскрытие информации

Раскрывать нечего.

Благодарности

Этот проект был частично профинансирован за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, под номером ZIA BC 010329.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies 
HaloTag® mouse monoclonal antibodyPromegaG9211 Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibodyR&D SystemsMAB10026Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10) Santa Crus Biotechnologysc-7267Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibodyAmershamNA931-1ML Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9Roche/Sigma6365809001
NanoBRET™ kit PromegaN1661 NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate 
DPBS, without Ca++ and Mg++ Quality Biologicals 114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Life Technologies25300120
DMEM cell culture mediaLife Technologies11995073High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)  Life Technologies25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies  15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media Gibco31985062For cell transfection 
Opti-MEM reduced serum media, no phenol redGibco11058021For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). 
Invitrogen Trypan Blue Stain Thermo Scientific T10282 
NP40 lysis buffer N/AN/A20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample bufferN/AN/A240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. 
Cell lines 
293FT cells (human)Thermo Scientific R70007 
DNA vectors 
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant N/AN/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo  N/AN/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate ReaderPerkinElmer 21042104-0010 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter Thermo ScientificAMQAX1000 
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor Thermo Scientific  4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3) GraphPad www.graphpad.com
Other 
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips Thermo Scientific 94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile Thomas Scientific1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™PerkinElmer6007680White, polystyrene, tissue culture treated 
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Scientific C10228

Ссылки

  1. Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
  2. Blasco, M. T., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

205CRAFRAFKRASRAFRAFRAF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены