Интратекальное введение вектора молодым крысам путем инъекции поясничного отдела цистерны

Резюме

Описана хирургическая методика выполнения инъекций в поясничный резервуар молодого крыса. Этот подход использовался для интратекальной доставки векторов генной терапии, но ожидается, что этот подход может быть использован для различных терапевтических средств, включая клетки и лекарственные препараты.

Аннотация

Генная терапия — это мощная технология доставки новых генов пациенту для лечения заболевания, будь то введение функционального гена, инактивация токсичного гена или предоставление гена, продукт которого может модулировать биологию заболевания. Метод доставки терапевтического вектора может принимать различные формы, начиная от внутривенной инфузии для системной доставки и заканчивая прямым введением в ткань-мишень. При нейродегенеративных расстройствах часто желательно смещение трансдукции в сторону головного и/или спинного мозга. Наименее инвазивный подход к воздействию, направленный на всю центральную нервную систему, включает в себя инъекции в спинномозговую жидкость (ликвор), что позволяет терапевтическому эффекту достичь значительной части центральной нервной системы. Наиболее безопасным подходом для введения вектора в спинномозговую жидкость является поясничная интратекальная инъекция, при которой игла вводится в поясничный резервуар спинного мозга. Этот метод, также известный как люмбальная пункция, широко используется у новорожденных и взрослых грызунов, а также на крупных моделях животных. Несмотря на то, что метод схож у разных видов и стадий развития, тонкие различия в размере, структуре и эластичности тканей, окружающих интратекальное пространство, требуют аккомодации в подходе. В данной статье описан метод проведения люмбальной пункции у молодых крыс с целью доставки аденоассоциированного вектора серотипа 9. Здесь 25-35 мкл вектора вводили в поясничный отдел позвоночника, а для оценки профиля трансдукции, полученного в результате каждой инъекции, использовали репортер зеленого флуоресцентного белка (GFP). Обсуждаются преимущества и проблемы такого подхода.

Введение

Перспектива вирусно-опосредованной генной терапии, наконец, была реализована в последние годы с одобрением FDA методов лечения спинальной мышечной атрофии, дистрофии сетчатки, гемофилии фактора IX, рака ^{и других заболеваний}. В настоящее время в разработке находится бесчисленное множество других терапевтических средств. Генная терапия направлена на доставку терапевтического гена в клетки пациента. Продукты этого нового гена могут замещать недостающую активность дефицитного эндогенного гена, ингибировать токсичный ген, убивать раковые клетки и....

протокол

Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Эмори. В настоящем исследовании использовались крысы Спрэг-Доули (возраст 28-30 дней, масса около 90-135 г, самцы и самки).

1. Подготовка вектора

1. Разморозьте вектор AAV9 (см. Таблицу материалов) на льду в начале процедуры.
2. Кратковременно центрифугируйте микроцентрифужную пробирку, содержащую вектор, в настольной центрифуге, чтобы убедиться, что вся жидкость находится на дне пробирки.
3. Осторожно переверните микроцентрифужную пробирку, чтобы убедиться, что раств....

Результаты

Чтобы определить точность техники инъекции, в качестве суррогата терапевтического препарата был использован краситель трипановый синий. Этот краситель легко связывается с белками, поэтому он обычно остается в структуре, в которую был введен. Это означает, что краситель может неточно ?.......

Обсуждение

Самые разнообразные заболевания поражают ЦНС. Предоставление функциональной копии соответствующего гена с помощью вирусного вектора является привлекательной стратегией лечения рецессивных и моногенных заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия. Тем не менее, гематоэнцефал.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection