Диссекция, гистологическая обработка и анализ экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей

Резюме

Здесь мы предлагаем практическую процедуру препарирования и проведения гистологического анализа и анализа экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей.

Аннотация

Опосредованный бурой жировой тканью (BAT) термогенез играет важную роль в регуляции метаболизма, и на его морфологию и функцию могут сильно влиять стимулы окружающей среды у мышей и людей. В настоящее время мышиный межлопаточный BAT (iBAT), который расположен между двумя лопатками в верхнем дорсальном боку мышей, является основным хранилищем BAT, используемым исследовательскими лабораториями для изучения функции BAT. Недавно у мышей было идентифицировано несколько ранее неизвестных депо BAT, в том числе одно, аналогичное надключичной коричневой жировой ткани человека. В отличие от iBAT, мышиная надключичная бурая жировая ткань (scBAT) расположена в промежуточном слое шеи и, таким образом, не может быть легко доступна.

Чтобы облегчить изучение недавно идентифицированного мышиного scBAT, в настоящем документе представлен протокол с подробным описанием шагов по препарированию интактного scBAT у постнатальных и взрослых мышей. Из-за небольшого размера scBAT по сравнению с другими жировыми депо, процедуры были модифицированы и оптимизированы специально для обработки scBAT. Среди этих модификаций – использование препарирующего микроскопа во время забора тканей для повышения точности и гомогенизации замороженных образцов scBAT для повышения эффективности последующего анализа кПЦР. С помощью этих оптимизаций можно определить идентификацию, морфологический вид и молекулярную характеристику scBAT у мышей.

Введение

Растущая распространенность ожирения в США и во всем мире вызвала большой интерес к пониманию его этиологии и выявлению потенциальных методов лечения ^1,2. Жировая ткань играет жизненно важную роль в обмене веществ, и дисрегуляция жировой ткани может привести к развитию ожирения. Как правило, существует два типа жировой ткани: белая и коричневая жировая ткань. В то время как белая жировая ткань (ВАТ) может накапливать химическую энергию и выделять эндокринные факторы, бурая жировая ткань (БАТ) может использовать химическую энергию для выработки тепла и поддержания температуры тела^{на холоде}

протокол

Процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском колледже Бэйлора. Все процедуры проводились на самцах мышей C57BL/6J в возрасте 3 недель и 3 месяцев. Перед вскрытием все мыши были подвергнуты эвтаназии с использованием одобренной процедуры эвтаназии углекислым газом для грызунов. См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протоколе.

1. Вскрытие scBAT

1. Положите тушку мыши на верстак и очистите хирургические ножницы и щипцы с тонким концом 70% этанолом.
2. Опрыск....

Результаты

В отличие от iBAT, который располагается в подкожном слое спины между двумя лопатками, scBAT располагается в промежуточном слое шеи, простираясь глубоко между слоями скелетных мышц и слюнной железы по мере роста вдоль наружной яремной вены (рис. 1A). Препарир.......

Обсуждение

В этом протоколе мы подробно представляем процедуры препарирования и обработки scBAT для анализа H&E и экспрессии генов. Поскольку scBAT находится в промежуточном слое шеи и располагается вдоль крупных вен, выделение этого депо требует точной техники. В частности, чтобы получить четкое пред?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)	Epredia	8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-well PCR plate	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Base Molds (for embedding)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ1500
DNase Dilution Solution	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elution solution	Bio-Rad	7326801
EM 400 embedding medium paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Embedding Cassettes	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Mortar Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (for 0.85% saline)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffin Section Flotation Bath	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’			Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (surface decontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Scintillation Vial (glass)	Electron Microscopy Sciences	72632
Slide drying bench	Electrothermal (Cole-Parmer)	MH6616
Stainless staining rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Stereo microscope (for embedding)	Olympus	SZ51
Sugical scissors	McKesson	43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)	Electron Microscopy Sciences	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Transfer pipette	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL