Методы быстрого отбора проб шести важнейших органов у взрослого Xenopus

Резюме

В этой статье представлено руководство по выборке шести важных и разнообразных органов у взрослого Xenopus , к которым можно быстро и легко получить доступ: желудочек сердца, доля печени, поджелудочная железа, жировые тела, парные почки и кожа.

Аннотация

Xenopus уже более ста лет является мощным модельным организмом для понимания развития и болезней позвоночных. В то время как методы экспериментального анализа и препарирования эмбриона хорошо задокументированы, описания структур и органов Xenopus взрослого человека, а также методы работы со взрослыми особями не были обновлены с учетом требований таких современных подходов, как количественная протеомика и транскриптомика одиночных клеток. Клеточный тип и геноцентрические перспективы требуют сопоставления наблюдений на эмбриональных стадиях с наблюдениями во взрослых тканях. Органы личинки претерпевают значительные изменения в своей общей структуре, морфологии и анатомическом расположении на всем протяжении перехода от личинки к взрослой особи, особенно во время массивного ремоделирования метаморфоза. Установление надежных стандартов для идентификации и препарирования органов имеет решающее значение для обеспечения согласованности наборов данных, полученных в результате исследований, проведенных в различных лабораториях. В настоящем протоколе определены шесть органов у взрослого Xenopus, демонстрируются методы вскрытия и взятия проб из желудочка сердца, печени, жирового тела, поджелудочной железы, парной почки и кожи взрослого Xenopus. В зависимости от методов консервации, препарированные органы могут быть использованы для количественной протеомики, транскриптомики одиночных клеток/ядер, гибридизации in situ , иммуногистохимии, гистологии и т.д. Этот протокол направлен на стандартизацию отбора образцов тканей и облегчение многолабораторных исследований систем органов взрослого человека.

Введение

Несмотря на то, что «цифровое вскрытие» взрослого Xenopus ^{доступно1}, воспроизводимый образец органов и тканей взрослого Xenopus остается сложной задачей без подробной инструкции, доступной для других взрослых моделей (например, мышей ^2,3,4). Цель этой статьи — предоставить четкое руководство по точному и воспроизводимому отбору проб органов взрослых особей Xenopus, аналогичному тому, который в настоящее время доступен для их личинок⁵. Акцент сделан на простоте заполнения, чтобы сохранить максимальную актуальность и сделать протокол доступным для всех пользователей.

Несмотря на то, что существует подробное руководство по вскрытию для Rana ^sp.6, а также многочисленные руководства по вскрытию в классе для других бесхвостых^{7, в} настоящее время не доступно руководство по вскрытию и взятию образцов Xenopus. Для тех, кто не знаком с практикой отбора проб или анатомией амфибий, небольшие различия между Xenopus и другими бесхвостыми делают эти ресурсы неоптимальными для воспроизводимых образцов тканей.

Многие ценные ткани не включены и даже отброшены в данном руководстве; Это необходимо для обеспечения свежести тканей. Шесть образцов достаточно ограничены, чтобы гарантировать, что эти ткани могут быть собраны менее чем через час после того, как сердце начнет биться, независимо от опыта или уровня квалификации пользователя. Более продвинутые и подробные руководства по сбору многих других тканей находятся в стадии подготовки в виде отдельных сопутствующих документов.

Для менее опытных пользователей всегда рекомендуется сначала опробовать этот протокол на животных, которых усыпляют по причинам, отличным от экспериментов, прежде чем брать образцы любых животных, которых трудно заменить (т.е. трансгенных животных, животных преклонного возраста и т.д.). В идеале, все отобранные животные должны быть здоровыми, а если это самки, то овуляция не должна происходить в течение последних двух недель.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и нормами Гарвардской медицинской школы IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). Репрезентативные результаты показаны как для перфузированного, так и для неперфузионного самца взрослого альбиноса Xenopus laevis.

1. Подготовка к эксперименту

ПРИМЕЧАНИЕ: Если перед отбором проб соблюдается протокол^{перфузии 8} , перейдите к шагу 2.2.

1. Убедитесь, что научно-исследовательское учреждение одобрило методику эвтаназии, описанную в этом протоколе.
2. Приготовьте раствор из 5 г/л MS-222 (трикаина метансульфоната) и 5 г/л гидрокарбоната натрия (см. Таблицу материалов). Объем должен быть больше объема, необходимого для полного покрытия животных, подлежащих усыплению. Проверьте pH, чтобы убедиться, что он составляет ≥7.
3. Провести первичную эвтаназию путем помещения Xenopus в раствор для эвтаназии; Животное будет оставаться под водой в общей сложности 1 час.
4. Настройте станцию вскрытия таким образом, чтобы сразу после взятия проб все ткани можно было промыть в охлажденном PBS или 0,7x PBS⁹ (в зависимости от экспериментальных потребностей), проверить и обрезать под светом с 5-кратным (или большим) увеличением. Эта станция также должна позволять пользователю либо заменять все щипцы и ножницы, либо протирать их между использованиями.
5. После того, как лягушка пробыла в растворе 1 ч, первичная эвтаназия была завершена. Удалите лягушку и проверьте потерю болевой реакции, выполнив щиплет ногой.
6. Запишите соответствующие данные о животном, такие как вид, штамм, пол, возраст и состояние здоровья, а также о том, было ли оно перфузировано. Взвесьте Xenopus и выполните дополнительные измерения, такие как длина рыла и вентиляционного отверстия.
7. Положите лягушку на спину и прижмите конечности проксимальнее тела (рисунок 1).
8. С помощью ножниц для рассечения разрежьте кожу вверх по средней линии, а затем сбоку, сделав два лоскута.
9. Как показано на рисунке 2, определите белую линию и с помощью щипцов захватите ее и оттяните от целомической полости. Аккуратно разрежьте мускулатуру ножницами. Сделайте две заслонки из стенки полости. Отрежьте или приколите все клапаны в сторону.
10. Определите сердце, которое все еще будет биться. Используйте ножницы для препарирования, чтобы уменьшить коракоидные кости (Рисунок 2), чтобы получить лучший доступ к сердцу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердце перестало биться перед взятием пробы, следует отметить, что свежесть образца была нарушена.

2. Отбор проб

ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное было перфузировано, перейдите к шагу 2.2.

1. Определите тонкий перикард и подтяните его с помощью тканевых щипцов (рисунок 3).
2. С помощью кончика ножниц для иридэктомии аккуратно проделайте перфорацию перикарда, стараясь не порезать подлежащие ткани. Отшлифуйте перикард вверх от 3 камер сердца.
3. С помощью щипцов захватите желудочек за верхушку, определите, где он прикрепляется к ушным раковинам и артериальному стволу (рисунок 4), и разрежьте его ниже этих прикреплений (рисунок 5). При необходимости обрезайте желудочек так, чтобы не было видно тканей из предсердий или артериального ствола, а внутри желудочка все еще была видна светлая ткань клапана.
   Примечание: У животных без перфузии удаление желудочка может быть квалифицировано как вторичная эвтаназия.
4. Будут видны 3 доли печени (Рисунок 6 и Рисунок 7). Возьмитесь за губу левой доли (справа от наблюдателя) и осторожно приподнимите ее так, чтобы были видны печеночные и пузырные протоки (рисунок 8). Возьмите образец из нижней 1/3 лопасти ниже этих насадок (Рисунок 9).
5. Чтобы получить лучший доступ к тканям самки лягушки, полезно удалить яичник. Определите яичник, который покрыт слоем висцеральной брюшины, называемой зародышевым эпителием. Аккуратно сдвиньте лепестки, пока они не окажутся на своих сторонах, чтобы сделать видимой область прикрепления (Рисунок 10). Эти прикрепления находятся непосредственно вентрально по отношению к парной почке.
6. С помощью ножниц удалите яичники как можно ближе к почкам, не повреждая их (рисунок 11).
7. Осмотрите медиальную долю печени (также называемую передней долей) и обратите внимание, как она соединяется с желудком и двенадцатиперстной кишкой через брыжеечный и гепатопанкреатический проток (также называемый общим желчным протоком) (рис. 6, рис. 7 и рис. 8).
8. Разрежьте брыжейку, гепатодуоденальную связку с помощью иридэктомических ножниц, а также гепатопанкреатический проток там, где он встречается с двенадцатиперстной кишкой. Разорвите соединение поджелудочной железы и гепатопанкреатического протока с медиальной долей печени так, чтобы не прикреплялась темная ткань печени (рис. 12).
9. Обхватите живот зубчатыми щипцами и верхний конец поджелудочной железы тканевыми щипцами. При 5-кратном увеличении осторожно дразните поджелудочную железу от живота (Рисунок 13).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если он не отделится чисто, оставшаяся ткань поджелудочной железы будет видна и может быть отделена фрагментами. В качестве альтернативы поджелудочная железа может быть методично отделена с помощью иридэктомических ножниц и тканевых щипцов.
10. Обратившись к рисунку 14А, определите мочевой пузырь и удалите его, разрезав как можно ближе к клоаке. Выбросьте эту салфетку.
11. Обратившись к рисунку 14B, определите толстую кишку и натяните ее, чтобы разрезать толстую кишку как можно ближе к клоаке. Удалите и выбросьте весь пищеварительный канал, перерезав брюшину, где она прикрепляется к селезенке. Теперь полные тела будут полностью доступны.
12. Раздразните толстые тела так, чтобы они оказались на своих сторонах. Область над почкой, где жировое тело соединяется с брюшиной, будет видна. Возьмитесь за основание левого жирового тела (справа от зрителя) и ножницами отрежьте его от брюшины, оставив небольшой запас, чтобы почка не была повреждена (рисунок 15).
13. Удалите и отбросьте остатки жировой ткани. Теперь парные почки будут полностью видны.
14. У самок лягушек или самцов с отчетливыми рудиментарными яйцеводами возьмите яйцевод и оттяните его от почки и клоаки (рис. 16). Разрежьте яйцевод в том месте, где он встречается с клоакой, и продолжайте оттягивать его от почки, обрезая все прозрачные брюшинные прикрепления по мере их становления очевидными. Выбросьте эту салфетку.
15. Повторите этот процесс с оставшимся яйцеводом.
16. Почки по-прежнему покрыты прозрачной брюшиной (забрюшинной)¹⁰. С помощью щипцов захватите почки и разрежьте брюшину на их нижнем конце.
17. Поднимите почки из целомической полости, используя ножницы, чтобы разрезать брюшину как можно ближе к почкам, не повреждая их (Рисунок 17).
18. При 5-кратном увеличении отрежьте лишнюю брюшину и любые другие оставшиеся ткани (жировые тела, селезенку). Если лягушка самка, убедитесь, что вся оставшаяся ткань яичника удалена (Рисунок 18). Если лягушка самец, осторожно удалите яичко и проверьте наличие рудиментарного яйцевода, который может быть не виден без увеличения (Рисунок 19).
19. Извлеките булавки из животного, наденьте его на вентиляционное отверстие и снова приколите конечности животного.
20. Выберите любую заднюю конечность для образца и приколите ногу этой конечности.
21. Удалите миндалевидный лоскут кожи над икроножной мышцей/большеберцовой мышцей (рисунок 20).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя рисунки с 1 по 20 и следуя всем шагам этого протокола, желудочек сердца, левая доля печени, поджелудочная железа, левые жировые тела, парные почки и лоскут кожи были аккуратно иссечены в течение часа после эвтаназии. В течение этого времени образц...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Поскольку этот протокол направлен на максимальную свежесть, некоторые образцы могут содержать нежелательные ткани. Например, гепатопанкреатический проток и некоторые брыжейки берутся вместе с поджелудочной железой, а некоторая перитонеальная ткань, надпочечники и мочеточники всегд...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying Glass with LED Light and Stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable Transfer Pipets	VWR	414004-036
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection Tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Iridectomy Scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Sodium Bicarbonate, Powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen Forceps, Serrated	VWR	82027-442
T-Pins for Dissecting	Fisher Scinetific	S99385