JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Дендритные шипики являются постсинаптическими компартментами большинства возбуждающих синапсов. Изменения морфологии дендритного отростка происходят во время неврологического развития, старения, обучения и многих неврологических и психиатрических расстройств, что подчеркивает важность надежного анализа дендритного отростка. Этот протокол описывает точную и воспроизводимую количественную оценку морфологии дендритных шипиков с помощью программного обеспечения для автоматической трехмерной реконструкции нейронов.

Аннотация

Синаптические связи обеспечивают обмен и обработку информации между нейронами. Постсинаптический участок возбуждающих синапсов часто формируется на дендритных шипах. Дендритные шипики представляют большой интерес для исследований, сосредоточенных вокруг синаптической пластичности, развития нервной системы, а также неврологических и психиатрических расстройств. Дендритные шипики претерпевают структурные изменения в течение своей жизни, при этом такие свойства, как общее количество шипов, размер дендритных шипиков и морфологически определенный подтип, изменяются в ответ на различные процессы. Определение молекулярных механизмов, регулирующих эти структурные изменения дендритных шипов, основано на морфологических измерениях. Это требует точного и воспроизводимого дендритного анализа позвоночника для получения экспериментальных данных. В настоящем исследовании представлен подробный протокол количественной оценки и классификации дендритных отростков с использованием Neurolucida 360 (программное обеспечение для автоматической трехмерной реконструкции нейронов). Этот протокол позволяет определить ключевые свойства дендритного шипика, такие как общая плотность позвоночника, объем головки позвоночника и классификация по подтипам позвоночника, что позволяет эффективно анализировать структурные фенотипы дендритного шипика.

Введение

Дендритные шипики представляют собой выступы дендритов, часто составляющие постсинаптический участок глутаматергических синапсов 1,2. Дендритные шипики представляют особый интерес в области синаптической пластичности. Позвоночники часто изменяются при изменении синаптической силы, становясь больше и сильнее при длительной синаптической потенциации или меньше и слабее при долгосрочной синаптической депрессии 3,4,5,6,7. Помимо синаптической пластичности, профиль дендритных шипиков меняется на протяжении всей жизни. На ранних этапах развития наступает период формирования и роста дендритных шипов, за которым следует обрезка дендритных шипиков до достижения устойчивого состояния 8,9,10. В стареющем мозге потеря позвоночника сопровождается уменьшением мозга и снижением когнитивныхфункций11. Кроме того, многие неврологические, нейродегенеративные и психические расстройства характеризуются аберрантными дендритными шипами. Множественные области мозга у людей, страдающих шизофренией, имеют меньшее количество дендритных шипиков, что, вероятно, является результатом измененной синаптическойобрезки. Расстройства аутистического спектра также характеризуются дендритными патологиями позвоночника13. Дендритная потеря позвоночника является отличительной чертой как болезни Альцгеймера, так и болезни Паркинсона14,15. Учитывая широкий спектр тем исследований, охватывающих изучение свойств дендритного шипа, методы точного количественного определения шипиков имеют первостепенное значение.

Окрашивание, т.е. метод Гольджи, или мечение нейронов с помощью наполнения красителя или экспрессии флуоресцентных белков являются распространенными методами визуализации дендритного позвоночника 16,17,18. После визуализации шипы могут быть проанализированы с помощью различных бесплатных и коммерчески доступных программных клиентов. Желаемые результаты анализа являются важным фактором при определении того, какое программное обеспечение будет наиболее полезным. Fiji — это жизнеспособный вариант программного обеспечения для вопросов, связанных с плотностью дендритных шипиков. Тем не менее, этот метод в значительной степени основан на трудоемком ручном подсчете, который может привести к систематической ошибке. Новые плагины, такие как SpineJ, позволяют проводить автоматическую количественную оценку, а также более точный анализ позвоночника и шеи19. Недостатком этих подходов является потеря трехмерного анализа для определения объема позвоночника, так как SpineJ ограничен двумерными стеками изображений. Кроме того, получение информации о подтипах позвоночника становится сложной задачей с помощью этих процессов. Четыре преобладающих подтипа шипов: тонкий, грибовидный, короткий и филоподийный, все они связаны с индивидуальными функциями и в значительной степени классифицируются по морфологии20. Тонкие шипы характеризуются удлиненной шеей и четко выраженной головой21. Грибовидные колючки имеют гораздо более крупную и выраженную головку22. Короткие шипы короткие и имеют небольшую вариативность между головой и шеей23. Филоподии – это неполовозрелые колючки с длинной, тонкой шеей и без явно заметной головы24. В то время как классификация предоставляет ценную информацию, шипы существуют в континууме измерений. Классификация по категориям основана на диапазонах морфологических измерений25,26. Ручное измерение корешков для классификации усложняет логистическую нагрузку для исследователей при таком подходе.

Другие варианты программного обеспечения, ориентированные конкретно на трехмерный дендритный анализ позвоночника, лучше подходят для исследований объема и свойств подтипов позвоночника 27,28,29,30,31. Несмотря на трудности, связанные с трехмерным анализом, такие как низкое разрешение в z-плоскости и размазывание, эти программные опции позволяют проводить надежную трехмерную реконструкцию дендритов и дендритных шипиков в полуавтоматическом режиме, управляемом пользователем. Автоматическая классификация идентифицированных позвоночников по их подтипам также присутствует в некоторых из этих программных пакетов для анализа позвоночника. Это может уменьшить опасения по поводу потенциальной рабочей нагрузки и экспериментальной систематической ошибки. Neurolucida 360 является одним из коммерчески доступных программ, позволяющих надежно и воспроизводимо идентификацию и классификацию трехмерных дендритных отростков32. Здесь мы представляем комплексный протокол для эффективной подготовки неподвижных тканей, получения изображений и, в конечном итоге, количественной оценки и классификации дендритных шипиков с помощью этого программного обеспечения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры на животных соответствовали рекомендациям Национального института здравоохранения США по использованию животных в внутренних исследованиях и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Национальным институтом психического здоровья.

1. Подготовка фиксированных срезов гиппокампа

  1. Обезболивайте мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина/ксилазина (кетамин: 100 мг/кг; Ксилазин: 8 мг/кг). Подтвердите анестезию с помощью зажима хвоста и приложите мышь к перфузионной пластине.
  2. С помощью больших хирургических ножниц удалите кожу и шерсть с грудной клетки, что позволит легче визуализировать подлежащую грудную клетку.
  3. Сделайте горизонтальный разрез ниже ширины грудной клетки, избегая печени и диафрагмы. С помощью тонких щипцов подтяните мечевидный отросток вверх и разрежьте каждую боковую сторону грудной клетки. Подверните грудную клетку вверх к области шеи и зафиксируйте на месте с помощью щипцов для гемостата.
  4. Введите иглу-бабочку 21 г в левый желудочек сердца и начните перфузию комнатной температурой 1x PBS со скоростью примерно 5 мл/мин. Сделайте небольшой надрез в правом предсердии маленькими хирургическими ножницами. Выполняйте с помощью PBS до тех пор, пока раствор не станет чистым.
  5. Выключите перфузионный насос, чтобы убедиться, что пузырьки не попадают в трубку. Поместите трубку из PBS в ледяной 4% параформальдегид (PFA) в PBS. Перфузию с ПФА со скоростью 5 мл/мин до полного окоченения животного, примерно 25 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что PFA свежий (не старше 1 недели, если запас хранится при температуре 4° C) для оптимальной фиксации.
  6. Снимите кожу с поверхности черепа с помощью небольших хирургических ножниц. Сделайте межсагиттальный надрез маленькими хирургическими ножницами вдоль центральной щели черепа. Сделайте боковые надрезы рострально к обонятельной луковице и над мозжечком.
  7. Вскройте череп тонкими щипцами, чтобы обнажить мозг. С помощью шпателя аккуратно вычерпните мозг из обонятельных луковиц и поместите 4% PFA в PBS на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более полного протокола перфузии грызунов, пожалуйста, обратитесь к Gage et al.33.
  8. Криопротекция неподвижного мозга путем замены 4% PFA на 15% сахарозы в PBS на 1 день. После этого замените 15% сахарозу на 30% сахарозу в растворе PBS на 1 день, пока мозг не погрузится в раствор.
  9. Извлеките мозг из раствора сахарозы и поместите его в чашку Петри с PBS. Отрежьте мозжечок и обонятельную луковицу с помощью лезвия скальпеля.
  10. Нанесите небольшое количество состава, 1-2 см в диаметре, оптимальной температуры резки (OCT) на поверхность держателя образца. Прикрепите мозг коронально к держателю образца с каудальной поверхностью разреза в ОКТ. Быстро заморозьте мозг, поместив держатель образца в измельченный сухой лед до видимого замерзания, примерно на 5-7 минут.
  11. Убедитесь, что угол наклона лопастей криостата установлен в диапазоне от 0° до 5° для получения однородных секций. Отрегулируйте угол наклона роликовой пластины для оптимального выравнивания ломтика. Пожалуйста, обратитесь к руководству по оборудованию для получения конкретных инструкций.
  12. Поместите держатель образца в криостат так, чтобы брюшная поверхность мозга была ближе всего к лезвию. Разрежьте мозг на дорсальные участки гиппокампа размером 30 мкм, отбросив все срезы рострально к гиппокампу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола может быть адаптирована к любой желаемой области мозга по выбору. Шаги 1.9-1.12 будут меняться в зависимости от интересующего региона.
  13. Перенесите дорсальные срезы гиппокампа в PBS. С помощью кисти аккуратно закрепите срезы гиппокампа на предметном стекле микроскопа. Удалите излишки раствора ватными палочками или деликатными салфетками.
  14. Нанесите на предметное стекло микроскопа 100 μл жестко закрепленной монтажной среды, охватывающей все срезы мозга. Чтобы предотвратить образование пузырей, медленно опустите покровное стекло с помощью щипцов на монтажный материал. Если образуются пузыри, осторожно постучите по покровному стеколе щипцами, чтобы они вырвались. Дайте предметным стеклам застыть на ночь перед визуализацией.

2. Конфокальная визуализация с высоким разрешением

  1. Используйте окуляры с малым увеличением для идентификации флуоресцентных клеток. Переключитесь на объектив с 63x (NA = 1.4) или выше, применяя к нему подходящую среду погружения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с объективом 63x или выше.
  2. Идентификация хорошо размеченных дендритных сегментов с ограниченным перекрытием для получения изображений. Установите мощность и коэффициент усиления лазера, чтобы гарантировать, что флуоресцентные дендриты не будут насыщены. Кроме того, снижение скорости сканирования может обеспечить лучшее разрешение изображения.
  3. Получение z-стеков, охватывающих полные дендритные сегменты, для будущего анализа. Z-стеки размером более 10 мкм нежелательны из-за дополнительной возможности дендритного перекрытия в z-плоскости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наименьший доступный размер z-шага (0,2-0,7 мкм) и 1 размер отверстия для воздушного блока. Меньший размер шага приводит к большему количеству изображений в z-стеке, компенсируя ограниченное разрешение Z многих микроскопов.
  4. Дополнительно: Если это возможно, используйте соответствующие функции программного обеспечения для деконволюции микроскопа для деконволюции изображений. Это позволит получать изображения с более высоким разрешением.

3. Количественная оценка дендритных отростков

  1. Откройте Neurolucida 360 (v2022.1.1 или более поздняя версия). Откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа позвоночника (File > Open > Image). Убедитесь, что файл изображения виден в главном окне и в 3D-окружении. Если окно 3D-окружения не появляется, щелкните левой кнопкой мыши по пункту «3D-окружение» на верхней панели инструментов главного окна на вкладке «Трассировка » (дополнительный рисунок 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола может быть адаптирован для любых дендритных изображений, а не только для дендритов из ткани мыши.
  2. Находясь на вкладке "Изменить отображение изображения " окна "3D-среда", убедитесь, что изображение отображается как 3D-объем в окне "Отобразить изображение как ". В поле «Параметры стека изображений » на вкладке «Изображение » выберите «Максимальная проекция » в раскрывающемся меню «Показать поверхность как ». (Дополнительный рисунок 2)
  3. Определите подходящий дендритный сегмент для трассировки.
    1. Щелкните левой кнопкой мыши инструмент «Переместить точку вращения » на верхней панели инструментов окна 3D среды . Щелкните левой кнопкой мыши по нужному дендриту, чтобы установить новую точку вращения. Это изменит ориентацию для обеспечения эффективного увеличения.
    2. Восстановите исходную ориентацию, щелкнув левой кнопкой мыши значок «Сбросить ориентацию ». После установки опорной точки щелкните левой кнопкой мыши по инструменту «Переместить точку вращения », чтобы начать трассировку дендрита. (Дополнительный рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный дендрит - это дендрит с ограниченным перекрытием с другими дендритами в любой из координатных плоскостей и не пересекающийся с другим дендритом или поверхностный по отношению к другому ниже. Дендриты, расположенные в небольшом соседстве с другими в плоскости XY, также предпочтительны для предотвращения неправильного отнесения соседних шипов к трассируемому дендриту. Следует также отметить, что дендриты разной толщины, порядка и расстояния от сомы имеют различную плотность дендритных шипиков34,35. Это должно быть учтено в плане эксперимента. Дендриты вторичного порядка толщиной <1,5 мкм являются идеальными кандидатами для трассировки (рис. 1).
  4. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку Дерево в окне 3D Окружающая среда . Щелкните левой кнопкой мыши User-Guided для режима трассировки и Directional Kernels в качестве метода в разделе User-Guided Tracing Options.
  5. Щелкните левой кнопкой мыши по дендриту, когда появится круглое ядро, чтобы начать трассировку. Переместите курсор вдоль дендритного сегмента. Это приведет к автоматическому заполнению ядер. Если ядра не заполняются автоматически, см. шаг 3.51.
    1. Аккуратно перемещайте курсор вперед и назад по дендриту, пока зерна не заполнятся. Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы сохранить существующие обнаруженные ядра. Если ядра перестают заполняться, щелкните левой кнопкой мыши, когда ядро заполняется дальше по дендриту, чтобы разместить его вручную. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы завершить трассировку. Убедитесь, что длина трассируемого дендрита составляет не менее 7 мкм (дополнительный рисунок 3).
  6. Проверьте точность трассировки дендритов, используя все три направления 3D-среды: тангаж, рыскание и крен, щелкнув левой кнопкой мыши и перетащив окно 3D-среды . Определите точки, в которых дендритная трассировка находится за пределами соответствующего местоположения на дендрите. Могут быть случаи, когда он выглядит точно прорисованным сверху вниз, но в z-измерении точки не находятся на дендрите (рис. 2).
  7. Чтобы исправить неправильно прорисованные дендритные сегменты, щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Правка » в меню «Дерево ». Щелкните левой кнопкой мыши на интересующем дендрите, затем щелкните левой кнопкой мыши по Точкам.
  8. Переместите неправильно расположенные точки обратно на сегмент дендрита с помощью щелчка и перетаскивания. Удалите лишние точки, щелкнув левую кнопку мыши по точке и нажав кнопку «Удалить ». Измените размер точек, если дендрит заполнен недостаточно. Чтобы изменить размер точки, щелкните левой кнопкой мыши по точке и отрегулируйте ползунок толщины, чтобы изменить размер (дополнительный рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаточно заполненные дендриты могут привести к идентификации ложных шипиков, которые являются компонентами дендритного сегмента. И наоборот, переполнение дендритов может затемнить истинные шипы.
  9. Повторите шаги 3.3-3.8 для множественных дендритов на изображении, прежде чем перейти к идентификации позвоночника на шаге 3.10.
  10. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Позвоночник » в окне «3D-среда». Установите настройки обнаружения для внешнего диапазона, минимальной высоты и минимального количества вокселей. В зависимости от подготовки может потребоваться изменение предустановленных значений в случае четкого и конкретного обоснования изменений. Предустановленные условия: Внешний диапазон: 2,5 мкм, Минимальная высота: 0,3 мкм, Минимальное количество вокселей: 10 вокселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные препараты, такие как клеточные культуры и острые ткани, а также различные временные точки развития потребуют различных критериев, которые должны быть выведены из существующей литературы. Также важно отметить, что изменение настроек обнаружения может значительно повлиять на результаты. Например, более высокий минимальный рост может исключить короткие шипы. Параметры обнаружения должны оставаться неизменными на протяжении всего эксперимента.
  11. Установите Чувствительность детектора на 70% и щелкните левой кнопкой мыши Обнаружить все. Это позволит заселить шипы, идентифицированные чувствительностью этого детектора, на всех дендритах. Если вы хотите выбрать шипы специфичным для дендритов способом, щелкните левой кнопкой мыши по окошку Щелкните изображение, чтобы обнаружить все на ближайшей ветви и щелкните левой кнопкой мыши по каждому дендриту вручную с разной чувствительностью детектора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе вполне естественно, что не все дендритные шипики будут заселены. Точно так же не-колючки могут неправильно заселяться. Начальная чувствительность в 70% также является гибкой; Это может измениться в зависимости от подготовки.
  12. Изучите шипы, выбранные этим детектором чувствительности, щелкнув и перетащив дендрит во всех трех направлениях. Если большинство обнаруженных колючек заполнены не полностью, переходим к пункту 3.12.1. Если обнаруженные колючки переполнены, перейдите к шагу 3.12.2. Если обнаруженные шипы кажутся достаточно заполненными, перейдите к шагу 3.13.
    1. Увеличьте Чувствительность детектора на 5%-10% и снова нажмите левую кнопку мыши «Обнаружить все». Это позволит заменить все ранее обнаруженные шипы на новые с более высокой чувствительностью. Повторяйте по мере необходимости, пока обнаруженные шипы не будут должным образом заполнены.
    2. Уменьшите Чувствительность детектора на 5%-10% и снова щелкните левой кнопкой мыши по кнопке «Обнаружить все». Это позволит заменить все ранее обнаруженные шипы на новые с меньшей чувствительностью. Повторяйте по мере необходимости, пока обнаруженные шипы не будут должным образом заполнены.
  13. Щелкните левой кнопкой мыши по кнопке "Сохранить существующие шипы " на вкладке "Позвоночник " в окне "3D-среда". Если выбран параметр «Щелкнуть изображение, чтобы обнаружить все на ближайшем ответвлении », снимите с него флажок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка флажка «Сохранить существующие шипы » гарантирует, что вновь идентифицированные дендритные шипы вручную не перезапишут ранее идентифицированные шипы. Убедитесь, что этот флажок выбран, прежде чем продолжить, чтобы не перезаписать предыдущую работу.
  14. Щелкните левой кнопкой мыши по Move Pivot Point и щелкните левой кнопкой мыши по дендриту, требующему дальнейшего обнаружения шипа, чтобы установить точку вращения.
    1. Снимите флажок «Переместить точку вращения». Определите незаполненный дендритный отросток. Увеличьте чувствительность детектора на 10%-20% по сравнению с предыдущим обнаружением и щелкните левой кнопкой мыши по корешку. Если обнаруженный позвоночник недооценен или переполнен, перейдите к пункту 3.14.3 или 3.14.4. Если позвоночник не заполняется, появится сообщение Не удалось обнаружить позвоночник в выбранном месте. В этом случае переходим к шагу 3.14.2.
    2. Увеличивайте чувствительность детектора постепенно, возможно, выше 100%, пока позвоночник не будет обнаружен и адекватно заполнен. Если позвоночник обнаружен, но недостаточно заполнен, перейдите к шагу 3.14.3. Если позвоночник переполнен, переходим к шагу 3.14.4 (рисунок 3).
    3. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Правка» и щелкните левой кнопкой мыши по недозаполненному корешку. Щелкните левой кнопкой мыши «Удалить». Снимите флажок на вкладке «Правка ». Увеличьте чувствительность на 5%-10% и кликните левой кнопкой мыши по позвоночнику. Повторите этот шаг, если позвоночник все еще недостаточно заполнен.
    4. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Правка» и щелкните левой кнопкой мыши по переполненному корешку. Щелкните левой кнопкой мыши «Удалить». Снимите флажок на вкладке «Правка ». Уменьшите чувствительность на 5%-10% и нажмите на корешок. Повторите этот шаг, если позвоночник все еще переполнен.
  15. Повторяйте шаги 3.14-3.14.4 до тех пор, пока не будут обнаружены все шипы, идентифицированные с помощью визуальной идентификации. Дважды проверьте дендрит на наличие шипов, принадлежащих соседним дендритам, ложных шипов, не соответствующих истинному сигналу, или потенциальных сегментов дендрита, ошибочно помеченных как шипы. Удалите эти ложные шипы с помощью функции «Удалить ».
  16. Осмотрите выявленные колючки на дендрите. В некоторых случаях несколько шипов могут выглядеть как один конгломератный позвоночник. Если кажется, что позвоночник включает в себя два шипа, щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Правка ». Щелкните левой кнопкой мыши корешок и щелкните левой кнопкой мыши «Скрыть выделенное». После подтверждения конгломератного корешка на вкладке «Правка » щелкните левой кнопкой мыши « Показать выделение » и выберите «Разделить». Если в одном конгломерате находится более двух шипов, возможно, потребуется повторить этот шаг (рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если конгломератный корешок не расщепляется после шага 3.16, удалите позвоночник. Затем выберите более интенсивный позвоночник конгломерата с более низкой чувствительностью. Как только более интенсивный позвоночник будет заполнен, увеличьте чувствительность, чтобы выбрать другой незаполненный позвоночник. В качестве альтернативы, удаление конгломератного шипа и последующее увеличение чувствительности может обеспечить правильное разделение.
  17. После того как все визуально идентифицируемые колючки обнаружены и заполнены соответствующим образом, на вкладке «Позвоночник » щелкните левой кнопкой мыши «Классифицировать все », чтобы классифицировать колючки по четырем подтипам: тонкие, грибовидные, короткие и филоподии (рис. 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры классификации позвоночника могут быть изменены в окне Настройки окна Классификация на вкладке Позвоночник . Как и в случае с настройками детектора, настоятельно рекомендуется иметь четкое обоснование изменения существующих параметров. Заданные значения: отношение головы к шее: 1,1, отношение длины к голове: 2,5, размер головки гриба: 0,35 мкм, длина филоподия - 3 мкм.
  18. На верхней панели инструментов окна 3D-среды выберите «Сохранить и просмотреть в Neurolucida Explorer». Neurolucida Explorer — это место, где собираются данные из трассировки. Работа будет сохранена в виде файла .dat, содержащего все кальки и корешки.
  19. В окне Проводник на вкладке Вид щелкните левой кнопкой мыши Выбрать все , чтобы выделить все дендриты и шипы.
  20. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Анализ» на верхней панели инструментов. Щелкните левой кнопкой мыши ниспадающее меню «Структура ». Щелкните левой кнопкой мыши Анализ разветвленной структуры (Branched Structure Analysis).
  21. В зависимости от интересующих переменных может быть выбран любой из анализов. Двумя наиболее полезными для вопросов, связанных с плотностью корешка и средним объемом корешка, являются «Каждое дерево > каждым дендритом » и «Шипы > детали шипа». Нажмите OK, и данные появятся в двух отдельных окнах.
  22. Скопируйте данные в электронную таблицу для дальнейшей компиляции и анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельное дерево будет отделено дендритами, но объем корешка не будет отделен. С помощью функции сортировки в таблице детали корешка можно отфильтровать по признакам.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Эффективное использование этого метода анализа начинается с выбора дендритных сегментов для трассировки. Как показано на рисунке 1, идеальные дендриты для трассировки не находятся в непосредственной близости от других дендритов. Дендриты, идущие пар...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе подробно описаны конкретные этапы подготовки образца, визуализации, а также процесс количественной оценки и классификации дендритных шипиков с использованием программного обеспечения для трехмерной реконструкции. Это программное обеспечение пред...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Выражаем благодарность за техническую помощь Кэролин Смит (Carolyn Smith), Саре Уильямс Аврам (Sarah Williams Avram), Теду Усдину (Ted Usdin) и NIMH SNIR (NIMH SNIR). Кроме того, мы хотели бы выразить признательность Исследовательской группе биомедицинских исследований Университета Колгейт в Бетесде. Эта работа поддерживается Внутренней программой NIMH (1ZIAMH002881 to Z.L.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
518F Immersion OilZeiss444960-0000-000
CryostatLeicaCM3050SFor slice preparation
Fine ForcepsFST11150-10
Hemostat ForcepsFST13020-12
Large Surgical ScissorsFST14002-16
LSM 880 Confocal MicroscopeZeissLSM 880
Microscope Cover GlassFisherbrand12-541-035
Mini-Peristaltic Pump IIHarvard Apparatus70-2027For perfusions
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1Spine Analysis Software
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1Spine Analysis Software
OCT CompoundSakura Finetek4583For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)FisherbrandF79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DICZeiss440762-9904-000
Scalpel BladeFST10022-00
Small Surgical ScissorsFST14060-09
Spatula FST10091-12
SucroseFIsherbrandS5-500
Superfrost Plus MicroslidesDiaggerES4951+
Vectashield HardSet Mounting MediumVector LaboratoriesH-1400-10

Ссылки

  1. Gray, E. G. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).
  2. Ramón Y Cajal, S. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).
  3. Desmond, N. L., Levy, W. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).
  4. Engert, F., Bonhoeffer, T. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).
  5. Yang, Y., Wang, X. B., Frerking, M., Zhou, Q. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).
  6. Oh, W. C., Parajuli, L. K., Zito, K. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).
  7. Shinoda, Y., Tanaka, T., Tominaga-Yoshino, K., Ogura, A. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).
  8. Markus, E. J., Petit, T. L. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).
  9. Duan, H., Wearne, S. L., Rocher, A. B., Macedo, A., Morrison, J. H., Hof, P. R. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).
  10. Chen, C. C., Lu, J., Zuo, Y. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).
  11. Dickstein, D. L., Weaver, C. M., Luebke, J. I., Hof, P. R. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).
  12. Glausier, J. R., Lewis, D. A. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).
  13. Phillips, M., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).
  14. Dorostkar, M. M., Zou, C., Blazquez-Llorca, L., Herms, J. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).
  15. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).
  16. Cheng, C., Trzcinski, O., Doering, L. C. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).
  17. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  18. Baloyannis, S. J. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).
  19. Levet, F., Tonnesen, J., Nagerl, U. V., Sibarita, J. B. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).
  20. Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).
  21. Pfeiffer, T., et al. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).
  22. Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
  23. Hering, H., Sheng, M. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).
  24. Jontes, J. D., Smith, S. J. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).
  25. Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).
  26. Berry, K. P., Nedivi, E. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
  27. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).
  28. Swanger, S. A., Yao, X., Gross, C., Bassell, G. J. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).
  29. Basu, S., et al. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).
  30. Ekaterina, P., Peter, V., Smirnova, D., Vyacheslav, C., Ilya, B. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).
  31. Li, B. Z., Sumera, A., Booker, S. A., Mccullagh, E. A. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).
  32. Dickstein, D. L., et al. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).
  33. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  34. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).
  35. Ferreira, J. S., et al. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).
  36. Megias, M., Emri, Z. s, Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).
  37. Katz, Y., et al. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).
  38. Bourne, J., Harris, K. M. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).
  39. Runge, K., Cardoso, C., De Chevigny, A. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).
  40. Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).
  41. Mattila, P. K., Lappalainen, P. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).
  42. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены