In This Article

Summary

Здесь мы представляем протокол фибриноген-полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов Sipunculus nudus.

Abstract

Фибриногенолитические агенты, которые могут растворять фибриноген напрямую, широко используются в антикоагулянтной терапии. Как правило, идентификация новых фибриногенолитических агентов требует сначала разделения каждого компонента, а затем проверки их фибриногенолитической активности. В настоящее время на стадии разделения в основном используются электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) и хроматография. Между тем, анализ фибриногенных пластин и продукты реакции на основе PAGE обычно используются для демонстрации их фибриногенолитической активности. Однако из-за пространственно-временного разделения этих двух стадий невозможно разделить и отобразить активные фибриногенлитические агенты с одним и тем же гелем. Чтобы упростить процессы разделения и отображения идентификации фибриногенолитических агентов, мы разработали новый метод fibrinogen-PAGE для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов арахисовых червей (Sipunculus nudus) в этом исследовании. Этот метод включает в себя получение фибриногена-PAGE, электрофорез, ренатурацию, инкубацию, окрашивание и обесцвечивание. Фибриногенолитическая активность и молекулярная масса белка могут быть обнаружены одновременно. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенолитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.

Introduction

В последние годы, в связи с продолжающимся ростом тромботических заболеваний, тромботические заболевания стали новойсерьезной глобальной проблемой здравоохранения1. В настоящее время антитромботические препараты классифицируются на три группы: антитромбоцитарные агрегирующие препараты, антикоагулянты и тромболитические препараты. Среди них тромболитические препараты, такие как урокиназа (Великобритания), тканевый активатор плазминогена (tPA) и др., являются единственными клинически применяемыми препаратами, способными гидролизовать тромб2. Между тем, разрабатываются более безопасные и эффективные тромболитические препараты путем идентификации новых тромболитических агентов3.

Тем не менее, идентификация новых тромболитических агентов является трудоемкой и трудоемкой процессией, которая в основном включает в себя этапы разделения/очистки и характеристики/проверки. Первый заключается в разделении каждого компонента, а второй в проявлении их фибрино(гено)литической активности 4,5. В предыдущих исследованиях, несмотря на то, что мы успешно выделили новый фибрино(гено)литический фермент (sFE) из арахисового червя (Sipunculus nudus) с помощью аффинной хроматографии и анализа фибрина (огена) 6,7,8, эти процессы являются очень трудоемкими и трудоемкими. Во-первых, необходимо определить, обладают ли гомогенаты арахисового червя фибрино(гено)литической активностью методом фибриновой пластины и продуктами реакции на основе стр.9. Затем необходимо провести серию хроматографий, таких как ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, аффинная хроматография и другие методы для разделения и очистки10,11. Затем снова проводится анализ фибриновой пластины для проверки фибриногенолитической активности каждого выделенного компонента. Наконец, для определения молекулярной массы активных фибриногенолитическихагентов проводят native-PAGE и додецилсульфат натрия (SDS)-PAGE. Поэтому крайне важно быстро отделять и выводить активные фибриногенолитические агенты.

Для быстрого разделения и отображения активных фибриногенолитических агентов в гомогенатах арахисового червя был разработан новый метод фибриноген-ПЕЙДЖ, сочетающий методы ПЕЙДЖ и фибриногенной пластины, т.е. субстраты фибриногенолитических агентов фибриногена были добавлены в нативный гель ПЕЙДЖ. После native-PAGE компоненты были разделены по их молекулярной массе. Между тем, каждый активный фибриногенолитический компонент может быть отображен путем окрашивания. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенлитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Гомогенат арахисового червя

  1. Добавьте в гомогенизатор 50 г арахисовых червей и 150 мл физиологического раствора.
  2. Гомогенизация при 24000 об/мин в течение 60 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите 3 раза.
  3. Центрифугируйте гомогенат при 9710 x g в течение 30 минут при 4 °C.
  4. Соберите надосадочную жидкость в виде гомогената арахисового червя для дальнейшего изучения.

2. Препарат геля Fibrinogen-PAGE

  1. Свесьте 0,01 г фибриногена в стеклянный стакан объемом 50 мл.
  2. Добавьте в стакан 1,9 мл DDH2O, 1,3 мл Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) и 0,05 мл SDS (10%, w/v); Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
  3. Поместите стакан при температуре 37 °C на 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предназначен для растворения фибриногена.
  4. Добавить 1,7 мл акриламида (30%, по массе), 0,05 мл персульфата аммония (APS; 10%, по массе), 0,002 мл TEMED; Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это разделительный гель.
  5. Вылейте разделительный гель в 10-луночную форму для геля.
  6. Добавьте 2 мл DDH2O в форму для геля; Ждем 30 мин.
  7. Тщательно удалите воду, перевернув форму вверх дном.
  8. Добавьте в стакан 1,4 мл DDH2O, 0,25 мл Tris-HCl (1,0 М, pH 6,8), 0,02 мл SDS (10%, w/v), 0,33 мл акриламида (30%, w/v), 0,02 мл APS (10%, w/v), 0,002 мл тетраметилэтилендамина (TEMED); Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это загружающий гель.
  9. Вылейте загружаемый гель в ту же форму для геля, что и шаг 2.5; Вставьте расческу сразу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый здесь гель fibrinogen-PAGE состоял из фибриногена (0,2%), содержащего разделительный гель и загружающий гель. Концентрацию фибриногена можно регулировать по мере необходимости.

3. Электрофорез

  1. Поместите приготовленный гель fibrinogen-PAGE вместе с клеевой формой в емкость для электрофореза; налить в бак 1300 мл раствора электрофореза (1,963 г Tris, 12,22 г глицина, 0,65 г SDS и 1300 мл DDH2O); Выньте расческу.
  2. Добавьте 5 мкл 5-кратного неденатурирующего загрузочного буфера к 20 мкл sFE и 20 мкл гомогената арахисового червя; хорошо перемешать с помощью пипетирования; Загрузите их в приготовленный гель фибриноген-ПЕЙДЖ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не кипятите смесь. sFE является фибрино(гено)литическим ферментом, идентифицированным ранее 6,7,8 и используемым в качестве положительного контроля в данном исследовании. Гомогенат арахисового червя является образцом, который необходимо обнаружить. Неденатурирующий загрузочный буфер без бромфенолового синего, β-меркаптоэтанола и SDS по сравнению с загрузочным буфером SDS-PAGE. Каждая полоса образца разделена с помощью загрузочного буфера SDS-PAGE 1x для четкого обнаружения движения белка.
  3. Проведите электрофорез при напряжении 80 В в течение 30 мин или 120 В в течение 20 мин.
  4. Удалите гель fibrinogen-PAGE из клеевой формы.

4. Ренатурация

  1. Переложите гель fibrinogen-PAGE в пластиковую коробку.
  2. Добавьте в коробку 100 мл Tris-HCl (0,05 М, pH 7,4) и 2 мл Triton X-100. Поместите его на шейкер при 60-70 оборотах в минуту на 10 минут.
  3. Снимите буфер для промывки с помощью пипетирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите три раза.

5. Инкубация

  1. Добавьте в пластиковую коробку 50 мл Tris-HCl (0,05 М, pH 7,4).
  2. Выдерживать при 37 °C в течение 4 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может быть скорректировано в зависимости от силы фибриногенолитической активности.

6. Окрашивание

  1. Удалите инкубационный буфер с помощью пипетирования.
  2. Добавьте в коробку 50 мл раствора Coomassie Brillant Blue Staining и поставьте коробку на шейкер при 60-70 об/мин на 30 минут.

7. Обесцвечивание

  1. Удалите окрашивающий раствор с помощью пипетирования.
  2. Добавьте в коробку 50 мл DDH2O.
  3. Поместите коробку на шейкер при 60-70 об/мин на 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве раствора для задержания здесь использовался DDH 2O. Время встряхивания может быть скорректировано в зависимости от силы фибриногенолитической активности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

После электрофореза все полосы маркера были четко отображены. На 1x полосах загрузки SDS-PAGE была только полоса 10 кДа (бромфенольный синий). В образцах sFE и арахисового червя не было обнаружено каких-либо наблюдаемых полос (Рисунок 1). Несмотря на то, что пол?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

sFE - это новый фибрино(гено)литический фермент, выделенный из арахисовых червей нашей командой ранее 3,6,8,13. Тем не менее, процессы идентификации sFE были трудоемкими и трудоемкими, включая определение ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось Научно-техническим бюро города Сямынь (No 3502Z20227197), Бюро науки и технологий провинции Фуцзянь (No 2019J01070; No 2022J01311) и проект «Инновации и предпринимательство высокого уровня» Плана науки и техники Цюаньчжоу (No 2022C015R). Мы благодарим Фуцай Вана (Университет Хуацяо) и Лэй Туна (Университет Хуацяо) за их техническую помощь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)SolarbioT1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)SolarbioT1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamideBiosharpBL513B
Ammonium persulfateXiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
BeakerPYREX2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)BiosharpBS-15-M
Constant Temperature IncubatorJINGHONGJHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solutionBeyotimeP0017F
Electronic Analytical BalanceDENVERTP-213
FibrinogenSolarbioF8051
Gel loading pipette tips, BulkBiosharpBS-200-GTB
HomogenizerAHSATS-1500
Horizontal rotation oscillatorNuoMiNMSP-600
Milli-Q ReferenceMilliporeZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-TetramethylethylenediamineSigmaT9281
Pipette Tip (1 mL)AxygeneT-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)AxygeneT-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)AxygeneT-200XT-C
Pipettor (1 mL)Thermo Fisher ScientificZY18723
Pipettor (10µL)Thermo Fisher ScientificZX98775
Pipettor (200 µL)Thermo Fisher ScientificZY20280
Pipettor (50 µL)Thermo Fisher ScientificZY15331
Refrigerated CentrifugecenceH1650R
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichV900859
TrisSolarbioT8060
Tris-HClSolarbioT8230
Triton X-100SolarbioT8200

References

  1. Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
  2. Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
  3. Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
  4. Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
  5. Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
  6. Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
  7. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
  8. Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
  9. Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
  10. Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
  11. Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
  12. Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
  13. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Sipunculus nudus