Быстрое разделение и отображение активных фибриногенолитических агентов в Sipunculus nudus с помощью электрофореза в фибриноген-полиакриламидном геле

Резюме

Здесь мы представляем протокол фибриноген-полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов Sipunculus nudus.

Аннотация

Фибриногенолитические агенты, которые могут растворять фибриноген напрямую, широко используются в антикоагулянтной терапии. Как правило, идентификация новых фибриногенолитических агентов требует сначала разделения каждого компонента, а затем проверки их фибриногенолитической активности. В настоящее время на стадии разделения в основном используются электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) и хроматография. Между тем, анализ фибриногенных пластин и продукты реакции на основе PAGE обычно используются для демонстрации их фибриногенолитической активности. Однако из-за пространственно-временного разделения этих двух стадий невозможно разделить и отобразить активные фибриногенлитические агенты с одним и тем же гелем. Чтобы упростить процессы разделения и отображения идентификации фибриногенолитических агентов, мы разработали новый метод fibrinogen-PAGE для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов арахисовых червей (Sipunculus nudus) в этом исследовании. Этот метод включает в себя получение фибриногена-PAGE, электрофорез, ренатурацию, инкубацию, окрашивание и обесцвечивание. Фибриногенолитическая активность и молекулярная масса белка могут быть обнаружены одновременно. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенолитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.

Введение

В последние годы, в связи с продолжающимся ростом тромботических заболеваний, тромботические заболевания стали новой^{серьезной глобальной проблемой} здравоохранения1. В настоящее время антитромботические препараты классифицируются на три группы: антитромбоцитарные агрегирующие препараты, антикоагулянты и тромболитические препараты. Среди них тромболитические препараты, такие как урокиназа (Великобритания), тканевый активатор плазминогена (tPA) и др., являются единственными клинически применяемыми препаратами, способными гидролизовать тромб². Между тем, разрабатываются более безопасные и эф....

протокол

1. Гомогенат арахисового червя

1. Добавьте в гомогенизатор 50 г арахисовых червей и 150 мл физиологического раствора.
2. Гомогенизация при 24000 об/мин в течение 60 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите 3 раза.
3. Центрифугируйте гомогенат при 9710 x g в течение 30 минут при 4 °C.
4. Соберите надосадочную жидкость в виде гомогената арахисового червя для дальнейшего изучения.

2. Препарат геля Fibrinogen-PAGE

1. Свесьте 0,01 г фибриногена в стеклянный стакан объемом 50 мл.
2. Добавьте в стакан 1,9 мл DDH₂O, 1,3 мл Tris....

Результаты

После электрофореза все полосы маркера были четко отображены. На 1x полосах загрузки SDS-PAGE была только полоса 10 кДа (бромфенольный синий). В образцах sFE и арахисового червя не было обнаружено каких-либо наблюдаемых полос (Рисунок 1). Несмотря на то, что пол?.......

Обсуждение

sFE - это новый фибрино(гено)литический фермент, выделенный из арахисовых червей нашей командой ранее 3,6,8,13. Тем не менее, процессы идентификации sFE были трудоемкими и трудоемкими, включая определение .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200