Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол фибриноген-полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов Sipunculus nudus.

Аннотация

Фибриногенолитические агенты, которые могут растворять фибриноген напрямую, широко используются в антикоагулянтной терапии. Как правило, идентификация новых фибриногенолитических агентов требует сначала разделения каждого компонента, а затем проверки их фибриногенолитической активности. В настоящее время на стадии разделения в основном используются электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) и хроматография. Между тем, анализ фибриногенных пластин и продукты реакции на основе PAGE обычно используются для демонстрации их фибриногенолитической активности. Однако из-за пространственно-временного разделения этих двух стадий невозможно разделить и отобразить активные фибриногенлитические агенты с одним и тем же гелем. Чтобы упростить процессы разделения и отображения идентификации фибриногенолитических агентов, мы разработали новый метод fibrinogen-PAGE для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов арахисовых червей (Sipunculus nudus) в этом исследовании. Этот метод включает в себя получение фибриногена-PAGE, электрофорез, ренатурацию, инкубацию, окрашивание и обесцвечивание. Фибриногенолитическая активность и молекулярная масса белка могут быть обнаружены одновременно. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенолитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.

Введение

В последние годы, в связи с продолжающимся ростом тромботических заболеваний, тромботические заболевания стали новойсерьезной глобальной проблемой здравоохранения1. В настоящее время антитромботические препараты классифицируются на три группы: антитромбоцитарные агрегирующие препараты, антикоагулянты и тромболитические препараты. Среди них тромболитические препараты, такие как урокиназа (Великобритания), тканевый активатор плазминогена (tPA) и др., являются единственными клинически применяемыми препаратами, способными гидролизовать тромб2. Между тем, разрабатываются более безопасные и эф....

протокол

1. Гомогенат арахисового червя

  1. Добавьте в гомогенизатор 50 г арахисовых червей и 150 мл физиологического раствора.
  2. Гомогенизация при 24000 об/мин в течение 60 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите 3 раза.
  3. Центрифугируйте гомогенат при 9710 x g в течение 30 минут при 4 °C.
  4. Соберите надосадочную жидкость в виде гомогената арахисового червя для дальнейшего изучения.

2. Препарат геля Fibrinogen-PAGE

  1. Свесьте 0,01 г фибриногена в стеклянный стакан объемом 50 мл.
  2. Добавьте в стакан 1,9 мл DDH2O, 1,3 мл Tris....

Результаты

После электрофореза все полосы маркера были четко отображены. На 1x полосах загрузки SDS-PAGE была только полоса 10 кДа (бромфенольный синий). В образцах sFE и арахисового червя не было обнаружено каких-либо наблюдаемых полос (Рисунок 1). Несмотря на то, что пол?.......

Обсуждение

sFE - это новый фибрино(гено)литический фермент, выделенный из арахисовых червей нашей командой ранее 3,6,8,13. Тем не менее, процессы идентификации sFE были трудоемкими и трудоемкими, включая определение .......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Это исследование финансировалось Научно-техническим бюро города Сямынь (No 3502Z20227197), Бюро науки и технологий провинции Фуцзянь (No 2019J01070; No 2022J01311) и проект «Инновации и предпринимательство высокого уровня» Плана науки и техники Цюаньчжоу (No 2022C015R). Мы благодарим Фуцай Вана (Университет Хуацяо) и Лэй Туна (Университет Хуацяо) за их техническую помощь.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)SolarbioT1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)SolarbioT1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamideBiosharpBL513B
Ammonium persulfateXiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
BeakerPYREX2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)BiosharpBS-15-M
Constant Temperature IncubatorJINGHONGJHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solutionBeyotimeP0017F
Electronic Analytical BalanceDENVERTP-213
FibrinogenSolarbioF8051
Gel loading pipette tips, BulkBiosharpBS-200-GTB
HomogenizerAHSATS-1500
Horizontal rotation oscillatorNuoMiNMSP-600
Milli-Q ReferenceMilliporeZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-TetramethylethylenediamineSigmaT9281
Pipette Tip (1 mL)AxygeneT-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)AxygeneT-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)AxygeneT-200XT-C
Pipettor (1 mL)Thermo Fisher ScientificZY18723
Pipettor (10µL)Thermo Fisher ScientificZX98775
Pipettor (200 µL)Thermo Fisher ScientificZY20280
Pipettor (50 µL)Thermo Fisher ScientificZY15331
Refrigerated CentrifugecenceH1650R
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichV900859
TrisSolarbioT8060
Tris-HClSolarbioT8230
Triton X-100SolarbioT8200

Ссылки

  1. Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
  2. Tsivgoulis, G., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Sipunculus nudus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены