Исследование контуров сетчатки и молекулярной локализации с помощью иммуноэлектронной микроскопии перед встраиванием

Резюме

В этом протоколе подробно описаны этапы предварительной иммуноэлектронной микроскопии с акцентом на изучение синаптических цепей и локализации белков в сетчатке.

Аннотация

Сетчатка состоит из многочисленных клеток, образующих различные нейронные цепи, которые составляют первую стадию зрительного пути. Каждая цепь характеризуется уникальными особенностями и различными нейротрансмиттерами, определяющими ее роль и функциональное значение. Учитывая сложность типов клеток в ее структуре, сложность нейронных цепей в сетчатке создает проблемы для исследования. Чтобы лучше исследовать цепи сетчатки и перекрестные помехи, такие как связь между колбочками и палочками, а также точную молекулярную локализацию (нейротрансмиттеры или нейропептиды), такую как наличие вещества Р-подобной иммунореактивности в сетчатке мыши, мы использовали метод иммуноэлектронной микроскопии (иммуно-ЭМ) для изучения синаптических связей и организации. Этот подход позволяет нам точно определить специфические межклеточные синаптические связи и точную молекулярную локализацию, а также может сыграть ведущую роль в изучении его функции. В этой статье описывается протокол, используемые реагенты и подробные шаги, включая (1) подготовку к фиксации сетчатки, (2) предварительное иммуноокрашивание и (3) постфиксацию и встраивание.

Введение

Сложность нейронных цепей в сетчатке представляет трудности для исследования, учитывая разнообразие типов клеток в ее структуре ^1,2. Начальный этап включает в себя выявление синаптических связей между различными клетками и определение клеточной локализации специфических нейротрансмиттеров или нейропептидов. По мере того, как молекулярная биология вводит новые белки, точная локализация в сетчатке становится решающей для понимания их функций и анализа цепей сетчатки и синаптических связей ^3,4,5

протокол

Уход за животными и обращение с ними были одобрены Положением Комитета по этике Медицинского университета Вэньчжоу в соответствии с руководящими принципами ARVO. В этом исследовании были использованы взрослые мыши (C57BL/6J, самцы и самки, в возрасте от 8 до 12 недель). Оборудование и реактивы, необходимые для проведения исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка к фиксации сетчатки

1. Соберите следующие материалы и инструменты: препарирующий микроскоп, два щипца с очень тонкими наконечниками, ножницы, иглу для шприца объемом 1 мл (размер иглы: G26....

Результаты

На рисунке 1 приведены примеры контрольных экспериментов без инкубации первичных антител против протеинкиназы С-альфа (PKCα) или SP, в которых не было обнаружено иммунореактивности (ИР).

На рисунке 2 изображен PKCα-IR в сетчатк.......

Обсуждение

В этой статье описаны три критических шага для успешного наблюдения синаптических цепей и локализации белка: (1) быстрая и слабая фиксация, (2) предварительное иммуноокрашивание и (3) постфиксация и встраивание.

Мы предполагаем, что фиксация является ключ.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe needle	kangdelai
1% OsO4	Electron Microscopy Science	19100
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
8% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Anti-rabbit PKC	Sigma-Aldrich	P4334
Anti-Rabbit SP	Abcam	ab67006
DAB Substrate kit	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors	Suzhou66 vision company	54010
Electron microscope	Phillips	CM120
Epon resin	Electron Microscopy Science	14910
forcep	Suzhou66 vision company	S101A
Millipore filter paper	Merck Millipore	PR05538
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
Picric acid	Electron Microscopy Science	19550
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
Ultramicrotome	Leica
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001