13МечениеC6-глюкозы, ассоциированное с LC-MS: идентификация первичных органов растений в синтезе вторичных метаболитов

Резюме

Разработанный метод мечения ¹³C_6-Glucose в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения жидкостной хроматографии является универсальным и закладывает основу для будущих исследований первичных органов и путей, участвующих в синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях, а также комплексной утилизации этих вторичных метаболитов.

Аннотация

В данной работе представлен новый и эффективный метод сертификации первичных органов, участвующих в синтезе вторичных метаболитов. В качестве важнейшего вторичного метаболита у Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Рука. -Mzt. (PPY), сапонин парижский (PS) обладает разнообразной фармакологической активностью, и PPY пользуется все большим спросом. В этом исследовании было установлено, что листья, корневище и стеблево-сосудистый пучок ¹³C_{6-глюкозы} с кормлением и без кормления точно сертифицируют первичные органы, участвующие в синтезе парижских сапонинов VII (PS VII). Комбинируя жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию (ЖХ-МС), были быстро и точно рассчитаны соотношения ¹³C/¹²C листьев, корневища, стебля и корня при различных обработках, а также были обнаружены четыре типа соотношений изотопических ионов PS (M^-): (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ и (M+4) ⁻/M⁻. Результаты показали, что соотношение ¹³С/¹²С в корневищах при лечении стволовым сосудистым пучком и корневищем было значительно выше, чем при лечении без кормления. По сравнению с обработкой без кормления, соотношение молекул PS VII (M+2) ^-/M⁻ в листьях значительно увеличивалось при обработке листьев и стеблевых, сосудисто-пучковых пучков. В то же время, по сравнению с обработкой без подкормки, соотношение молекул PS VII (М+2) ⁻/М⁻ в листьях при обработке корневищем не показало существенной разницы. Кроме того, соотношение молекул PS VII (M+2) ^-/M⁻ в стебле, корне и корневище не показало различий между четырьмя обработками. По сравнению с обработкой без подкормки, соотношение молекулы парижского сапонина II (PS II) (M+2) ^-/M⁻ в листьях при листовой обработке не показало существенной разницы, а соотношение (M+3) ^-/M⁻ молекул PS II в листьях при листовой обработке было ниже. Данные подтвердили, что первичным органом для синтеза PS VII являются листья. Это закладывает основу для будущей идентификации первичных органов и путей, участвующих в синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях.

Введение

Пути биосинтеза вторичных метаболитов в растениях сложны и разнообразны, в них задействованы высокоспецифичные и^{разнообразные органы} накопления. В настоящее время специфические места синтеза и органы, ответственные за вторичные метаболиты во многих лекарственных растениях, четко не определены. Эта неопределенность представляет собой серьезное препятствие для стратегического продвижения и внедрения методов выращивания, разработанных для оптимизации как урожайности, так и качества лекарственных материалов.

Молекулярная биология, биохимия и методы мечения изотопов широко используются для раскрытия путей синтеза и сайтов....

протокол

1. Подготовка к эксперименту

1. Убедитесь, что во время роста растений относительная влажность воздуха в теплице составляет 75%, дневная/ночная температура составляет 20 °C/10 °C, фотопериод состоит из 12 часов дня и 12 часов ночи, а интенсивность света составляет 100 моль·^м-2·^с-1. Обеспечьте излучение с помощью светодиодных (LED) ламп, соблюдая расстояние 30 см между светодиодной лампой и пологом растения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фотопериод и интенсивность света зависят от количества солнечных часов в течение вегетационного периода в Юньнани. Интенсивность излучения обычно измеряется квантовым датчиком (см. Таблицу материа....

Результаты

Чтобы подтвердить, что поступление ¹³_{С-6-глюкозы} в корневища было успешным, мы дополнительно проанализировали соотношения изотопов ¹³С/¹²С в корневищах. Соотношение изотопов ¹³C/¹²C в Обработке 3 и 4 было намного выше, чем в Обработке 2 (Рисунок 1A

Обсуждение

Успешная реализация этого протокола зависит от всесторонних исследований физиологических свойств растений, тканей, органов и вторичных метаболитов. Подход к планированию эксперимента, изложенный в протоколе, закладывает прочную основу для исследования путей биосинтеза вторичных ме.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2