Подготовка образцов сетчатки к объемной электронной микроскопии

Резюме

В этом протоколе подробно описаны этапы подготовки образцов сетчатки для объемной электронной микроскопии, уделяя особое внимание структурным особенностям фоторецепторных окончаний сетчатки.

Аннотация

Объемная электронная микроскопия (Volume EM) стала мощным инструментом для визуализации трехмерной структуры клеток и тканей с нанометровой точностью. Внутри сетчатки различные типы нейронов устанавливают синаптические связи во внутреннем и внешнем плексиформных слоях. В то время как традиционные методы ЭМ позволили получить ценную информацию о субклеточных органеллах сетчатки, их ограничение заключается в предоставлении данных 2D-изображений, что может затруднить точные измерения. Например, количественная оценка размера трех различных бассейнов синаптических везикул, имеющих решающее значение для синаптической передачи, является сложной задачей в 2D. Volume EM предлагает решение, предоставляющее крупномасштабные 3D-данные с высоким разрешением. Стоит отметить, что подготовка образцов является критически важным этапом в Volume EM, значительно влияющим на четкость и контрастность изображения. В этом контексте мы описываем протокол подготовки образцов для 3D-реконструкции окончаний аксонов фоторецепторов в сетчатке. Этот протокол включает в себя три ключевых этапа: диссекция и фиксация сетчатки, процессы встраивания образца и выбор области интереса.

Введение

Сетчатка плотно заполнена переплетающимися нейронными аксонами и дендритами, которые образуют синапсы между ними¹. Микроскопия является незаменимым инструментом для изучения анатомии сетчатки, так как она имеет тонкие, сложные и мелкие структуры. Несмотря на то, что электронная микроскопия (ЭМ) обеспечивает беспрецедентную мощность для исследования ультраструктуры субклеточных органелл и точной локализации специфических белков на нанометровом уровне², она позволяет получать изображения, ограниченные двумерной (2D) плоскостью, что приводит к потенциальной потере ключевой информации.

<....

протокол

Протоколы ухода за животными и их использования были одобрены Комитетом по этике Медицинского университета Вэньчжоу и соответствовали рекомендациям, установленным Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO). Все мыши содержались в 12-часовом солнечном и 12-часовом темном цикле и получали стандартную диету чау-чау.

1. Диссекция и фиксация сетчатки

1. Обезболивайте мышей (C57BL/6J, самец, 8 недель, 20-25 г) путем внутрибрюшинного введения 2,2,2-трибромэтанола (0,25 мг/г массы тела). Подтвердите глубину анестезии отсутствием втягивания задней лапы после защемления п....

Результаты

На рисунке 1А представлено изображение фоторецепторных окончаний сетчатки, полученных с использованием традиционного химического метода двойной фиксации, а на рисунке 1В представлено изображение фоторецепторных окончаний сетчатки, .......

Обсуждение

Мы реализовали протокол подготовки образцов OTO Volume EM для анализа концевой структуры фоторецепторов в ткани сетчатки. Основное внимание было уделено детализации всей процедуры, начиная от отслойки и фиксации сетчатки и заканчивая демонстрацией результатов 3D-реконст?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049