Подготовка образцов сетчатки к объемной электронной микроскопии

Резюме

В этом протоколе подробно описаны этапы подготовки образцов сетчатки для объемной электронной микроскопии, уделяя особое внимание структурным особенностям фоторецепторных окончаний сетчатки.

Аннотация

Объемная электронная микроскопия (Volume EM) стала мощным инструментом для визуализации трехмерной структуры клеток и тканей с нанометровой точностью. Внутри сетчатки различные типы нейронов устанавливают синаптические связи во внутреннем и внешнем плексиформных слоях. В то время как традиционные методы ЭМ позволили получить ценную информацию о субклеточных органеллах сетчатки, их ограничение заключается в предоставлении данных 2D-изображений, что может затруднить точные измерения. Например, количественная оценка размера трех различных бассейнов синаптических везикул, имеющих решающее значение для синаптической передачи, является сложной задачей в 2D. Volume EM предлагает решение, предоставляющее крупномасштабные 3D-данные с высоким разрешением. Стоит отметить, что подготовка образцов является критически важным этапом в Volume EM, значительно влияющим на четкость и контрастность изображения. В этом контексте мы описываем протокол подготовки образцов для 3D-реконструкции окончаний аксонов фоторецепторов в сетчатке. Этот протокол включает в себя три ключевых этапа: диссекция и фиксация сетчатки, процессы встраивания образца и выбор области интереса.

Введение

Сетчатка плотно заполнена переплетающимися нейронными аксонами и дендритами, которые образуют синапсы между ними¹. Микроскопия является незаменимым инструментом для изучения анатомии сетчатки, так как она имеет тонкие, сложные и мелкие структуры. Несмотря на то, что электронная микроскопия (ЭМ) обеспечивает беспрецедентную мощность для исследования ультраструктуры субклеточных органелл и точной локализации специфических белков на нанометровом уровне², она позволяет получать изображения, ограниченные двумерной (2D) плоскостью, что приводит к потенциальной потере ключевой информации.

Развитие новых методов объемной электронной микроскопии с высоким разрешением (Volume EM) способствует предоставлению более полной и крупномасштабной трехмерной (3D) структурной информации. Некоторые методы 3D EM недавно были рассмотрены другими ^3,4,5. 3D EM позволяет реконструировать форму нейронов и детали связи, что позволяет проводить точный количественный анализ интересующих структур. Это свидетельствует о том, что данные, полученные с помощью объемной ЭМ, являются более систематичными, полными и точными.

Фоторецепторы сетчатки, составляющие исходные нейроны в зрительной сигнализации ^6,7, образуют синапсы с дендритами биполярных и горизонтальных клеток второго порядка в конце фоторецептора для облегчения возбуждающих сигналов ^8,9. Эти окончания, называемые конусными ножками и сферулами палочек, включают в себя три важнейших компонента: митохондрии, синаптические ленты и синаптические везикулы. В то время как предыдущие исследования в основном были сосредоточены на общей структуре ленточных синапсов, было заметно отсутствие исследований тонкой структуры основных компонентов, включая митохондрии, ленты, везикулы, и их пространственной организации в терминалах 10,11,12,13. Точный и систематический анализ каждого компонента, наряду с пониманием их взаимосвязи в фоторецепторных окончаниях, жизненно важен для разгадки пространственной организации и всестороннего понимания функций визуальной обработки. В фоторецепторах митохондрии в основном присутствуют во внутреннем сегменте, теле клетки и терминале. Здесь мы сосредоточились на митохондриях в терминальных фоторецепторах. Сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионным пучком (FIB-SEM) — тип объемной ЭМ с высоким разрешением (x, y и z < 5 нм) и относительно большим объемным потоком ^4,14 — является мощным инструментом для точной визуализации трехмерной структуры фоторецепторных терминалов.

Как FIB-SEM, так и серийный блочный сканирующий электронный микроскоп (SBF-SEM) представляют собой объемную ЭМ на основе SEM для получения изображения тканей путем сканирования поверхности образца. Ультраструктурные особенности поверхности образца проявляются благодаря контрасту, создаваемому интенсивностью вторичных или обратно рассеянных электронов (BSE) при сканировании образца электронным пучком¹⁵. По существу, обнаружение ГЭКРС или вторичных электронов с поверхности поперечного сечения образца ткани, залитого смолой, в СЭМ позволяет получать изображения внедренного образца^16,17. Когда BSE или вторичные электроны генерируются меньше, информация о поверхности образца может быть получена только в объеме. Для получения стабильного контраста и высококачественных серийных изображений требуется достаточное осаждение тяжелых металлов в образце. Таким образом, конкретные протоколы пробоподготовки имеют решающее значение для последующей сегментации, 3D-реконструкции и анализа при использовании SEM для серийной визуализации. Метод осмий-тиокарбогидразид-осмий (ОТО) представляет собой типовую схему пробоподготовки для 3D электронной микроскопии биологических образцов, сохраняющую структуру липидсодержащих мембран и сохраняющую хороший контраст^18,19.

Здесь мы разработали метод ОТО для подготовки образцов сетчатки к использованию Volume EM. Этот процесс особенно сосредоточен на препарировании сетчатки, определении оптимального времени фиксации ткани сетчатки и подробном описании конкретных процедур и мер предосторожности при подготовке 3D-образцов. Кроме того, сегментация и 3D-реконструкция целевой структуры являются неотъемлемыми этапами этого расширенного приложения. Сетчатка, будучи небольшой и сложной структурой для получения материалов, требует быстрых и точных операций для ЭМ, с фиксированным временем и свежими реагентами, подготовленными для немедленного использования.

протокол

Протоколы ухода за животными и их использования были одобрены Комитетом по этике Медицинского университета Вэньчжоу и соответствовали рекомендациям, установленным Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO). Все мыши содержались в 12-часовом солнечном и 12-часовом темном цикле и получали стандартную диету чау-чау.

1. Диссекция и фиксация сетчатки

1. Обезболивайте мышей (C57BL/6J, самец, 8 недель, 20-25 г) путем внутрибрюшинного введения 2,2,2-трибромэтанола (0,25 мг/г массы тела). Подтвердите глубину анестезии отсутствием втягивания задней лапы после защемления пальца ноги или отсутствием мигающего рефлекса. Затем вывихните шейный позвонок, еще находясь под наркозом, чтобы усыпить животное.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трибромэтанол был выбран из-за его хорошо задокументированной эффективности в индуцировании быстрой и надежной анестезии на моделях мелких животных, особенно при краткосрочных процедурах. В то время как фармацевтические анестетики являются предпочтительными, трибромэтанол имеет определенные преимущества в определенных протоколах, что делает его подходящей альтернативой при правильном приготовлении и применении. Были приняты все меры предосторожности для обеспечения его безопасного и эффективного использования. Это исследование придерживается этических соображений, обеспечивая надлежащую подготовку, проведение и мониторинг для снижения потенциальных рисков, связанных с его использованием.
2. Удалите глаза изогнутыми ножницами и погрузите глаза в смешанный раствор, содержащий 2% глутаральдегида и 2% параформальдегида в фосфатном буфере (PB, 0,1 M, pH 7,4).
3. Удалите передний сегмент и стекловидное тело из глаз с помощью щипцов под препарирующим микроскопом.
4. Отклейте склеру двумя щипцами до тех пор, пока сетчатка не будет полностью изолирована от наглазника.
5. Быстро разрежьте сетчатку на полоски толщиной 100 - 200 мкм с помощью бритвы и обрабатывайте полоски сетчатки пипеткой Пастера в новой микроцентрифужной (EP) пробирке, содержащей 2% глутаральдегида и 2% параформальдегида в фосфатном буфере (PB, 0,1 M, pH 7,4) в течение 2 часов при комнатной температуре (RT) на ротаторе. После завершения поместите трубки для фиксации при температуре 4 °C на 24 часа.

2. Процесс встраивания образца

1. После промывки в 0,1 М буфере какодилата натрия (pH 7,4) 5 раз по 15 мин инкубировать полоски сетчатки раствором, содержащим 1,5% ферроцианида калия и 1% OsO₄ (в PB, pH7,4) в 0,1 М какодилата натрия с 4 мМ CaCl₂ в течение 1,5 ч в темноте на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Темная инкубация и недостаток фосфатов могут предотвратить выпадение осадков и появление артефактов в образце.
2. Промойте полоски сетчатки 3 раза в ddH₂O в течение 10 минут каждая, а затем обработайте 1% тиокарбогидразидом в ddH₂O в течение 30 минут в темноте в RT.
3. После полоскания в ddH₂O 3 раза по 15 мин каждый инкубируйте полоски сетчатки в 2% OsO4 (в PB, PH 7,4) в течение 45 мин в темноте при ЛТ.
4. После промывки в ddH₂O 3 раза по 15 мин погрузите полоски сетчатки в 1% водный уранилацетат в темноте при температуре 4 °C на ночь.
5. На следующий день, после промывания в ddH₂O 3 раза по 15 мин, обработайте полоски сетчатки 0,66% нитратом свинца в L-аспарагиновой кислоте (0,03 М, pH 5,5) в течение 40 мин при 65 °C.
6. После промывания в ddH₂O 3 раза по 15 минут каждый раз обезвоживайте полоски сетчатки с возрастающей концентрацией этанола 30%, 50%, 70%, 90% и 100% в течение 20 минут в каждом растворе.
7. Обработайте полоски сетчатки глаза смешанным раствором, содержащим равное количество этанола и ацетона, в течение 20 минут, после чего промывайте ацетоном 2 раза по 20 минут.
8. Инфильтрируйте полоски сетчатки в ацетон/смолу, смешанные в соотношении 7:3 в темноте при ЛТ, на ночь, а затем ацетон/смола в соотношении 3:7 в темноте в течение 24 ч при ЛТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точный состав смолы следующий: Epon812 10,06 мл, DDSA 4 мл, MNA 5,94 мл и DMP-30 0,2 мл.
9. На следующий день замените трубки и пропитайте полоски сетчатки чистой смолой в течение 24 часов при температуре 45 °C. На следующий день снова смените смолу и вставьте полоски сетчатки на 48 часов при температуре 60 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью повышения температуры является улучшение проникновения.

3. Выбор области интересов

1. Разрежьте смоляные блоки на срезы толщиной 1 мкм, окрасьте срезы 1% толуидинового синего и понаблюдайте за общей структурой сетчатки под световой микроскопией, чтобы выбрать шероховатые участки интереса.
2. Покрытие смоляных блоков платиной с помощью распылительного коастера с последующим фрезерованием с толщиной сечения 70 нм с помощью сканирующей электронной микроскопии с сфокусированным ионным пучком под действием тока 0,23 нА и разгонного напряжения 30 кВ.
3. Предварительно просмотрите срез с помощью FIB-SEM с 2000-кратным увеличением, чтобы определить точные области интереса.
4. Сбор данных осуществляется с помощью FIB-SEM с током луча 0,69 нА и напряжением ускорения 2 кВ. Остальные параметры следующие: время задержки = 2 μс, размер вокселя = 1,8 нм x 1,8 нм x 15 нм.

Результаты

На рисунке 1А представлено изображение фоторецепторных окончаний сетчатки, полученных с использованием традиционного химического метода двойной фиксации, а на рисунке 1В представлено изображение фоторецепторных окончаний сетчатки, ...

Обсуждение

Мы реализовали протокол подготовки образцов OTO Volume EM для анализа концевой структуры фоторецепторов в ткани сетчатки. Основное внимание было уделено детализации всей процедуры, начиная от отслойки и фиксации сетчатки и заканчивая демонстрацией результатов 3D-реконст?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049