Выделение костного мозга мышей у новорожденных и получение макрофагов костного мозга

Резюме

Этот протокол описывает неферментативный и простой метод выделения 7-9-дневных клеток костного мозга новорожденных мышей и получения дифференцированных макрофагов с использованием надосадочной жидкости клеток L929 в качестве источника гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (M-CSF). Макрофаги, полученные из костного мозга, были дополнительно проанализированы на поверхностные антигены F4/80, CD206, CD11b и функциональную компетентность.

Аннотация

Хорошо известны различные методы выделения костного мозга от взрослых мышей. Тем не менее, выделение костного мозга у неонатальных мышей является сложной и трудоемкой задачей, но для некоторых моделей это является трансляционно актуальным и необходимым. Этот протокол описывает эффективный и простой метод получения клеток костного мозга у 7-9-дневных щенков. Затем эти клетки могут быть дополнительно выделены или дифференцированы в конкретные типы клеток, представляющие интерес. Макрофаги являются важнейшими иммунными клетками, которые играют важную роль в воспалении и инфекции. Во время развития неонатальные макрофаги вносят значительный вклад в ремоделирование тканей. Более того, фенотип и функции неонатальных макрофагов отличаются от таковых у их взрослых собратьев. В этом протоколе также описана дифференцировка неонатальных макрофагов из выделенных клеток костного мозга в присутствии среды, кондиционированной L929. Поверхностные маркеры дифференцированных неонатальных макрофагов оценивали с помощью проточного цитометрического анализа. Для демонстрации функциональности фагоцитарная эффективность также была проверена с использованием pH-чувствительной красителя, конъюгированной с Escherichia coli.

Введение

Костный мозг включает в себя как гемопоэтические, так и мезенхимальные популяции стволовых клеток, которые являются самовозобновляемыми и могут дифференцироваться в различные клеточные линии. Гемопоэтические стволовые клетки в костном мозге дают начало миелоидным и лимфоидным линиям¹. Мезенхимальные стволовые клетки продуцируют остеобласты (кости), адипоциты (жир) или хондроциты (хрящи)². Эти клетки имеют множество применений в области клеточной биологии и тканевой инженерии, включая генную терапию ^3,4. Клетки-предшественники, присутствующие....

протокол

Все процедуры были одобрены Комитетами по уходу за животными и их использованию в учреждении Западной Вирджинии и выполнены в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальным исследовательским советом. Для исследования использовались мышиные щенки C57BL/6J. Подробная информация обо всех используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка СМИ

1. Приготовьте 3 мл питательных сред MEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ глутамина, 25 мМ HEPES и пенициллина (100 Ед/мл)/стрептомицина (100 мкг/мл) в центрифужной пробирке о....

Результаты

Используя метод, описанный в этом исследовании, можно успешно выделить от 25 до 37 миллионов клеток костного мозга из помета из пяти детенышей мышей C57BL/6. Этот метод был проверен при размерах помета от 5 до 7 щенков. Минимальный возраст для изоляции в наших экспериментах составлял 7 дней. В з.......

Обсуждение

Исследования с использованием неонатальных мышиных моделей могут быть сопряжены с рядом проблем. Новорожденные имеют развивающуюся иммунную систему, которая уникальна по сравнению со взрослыми⁸. Таким образом, данные, полученные на моделях взрослых животных, не должны пр.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal