JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает систему синтеза бесклеточного белка (CFPS), используемую при создании синтетических клеток. В нем описаны ключевые этапы с репрезентативными результатами в различных микрокомпартментах. Протокол направлен на установление передовых практик для различных лабораторий в сообществе синтетических клеток, способствуя прогрессу в разработке синтетических клеток.

Аннотация

Система бесклеточного синтеза белка (CFPS) широко используется для облегчения восходящей сборки синтетических клеток. Он служит хостом для основного механизма Центральной Догмы, выступая в качестве оптимального шасси для интеграции и сборки различных систем искусственной клеточной мимикрии. Несмотря на частое использование в производстве синтетических элементов, создание специализированной и надежной системы CFPS для конкретного применения остается нетривиальной задачей. В этой статье мы представляем комплексный протокол для системы CFPS, обычно используемой при создании синтетических клеток. Этот протокол включает в себя ключевые этапы подготовки системы CFPS, включая получение клеточного экстракта, подготовку матрицы и рутинную оптимизацию экспрессии с использованием флуоресцентного репортерного белка. Кроме того, мы демонстрируем репрезентативные результаты, инкапсулируя систему CFPS в различные микрокомпартменты, такие как монослойные капли, двойные эмульсионные везикулы и камеры, расположенные поверх поддерживаемых липидных бислоев. Наконец, мы разъясняем критические шаги и условия, необходимые для успешной сборки этих систем CFPS в различных средах. Мы ожидаем, что наш подход будет способствовать установлению хороших рабочих практик среди различных лабораторий в рамках постоянно расширяющегося сообщества синтетических клеток, тем самым ускоряя прогресс в области разработки синтетических клеток.

Введение

Синтез синтетических или искусственных клеток стал очень заметной областью междисциплинарных исследований, привлекая значительный интерес со стороны ученых в области синтетической биологии, химии и биофизики. Эти ученые объединены общей целью построения минимальной живой клетки 1,2,3. Быстрый рост этой области идет в ногу со значительными достижениями в критических технологиях, таких как манипуляции с рекомбинантной ДНК4, биомиметические материалы5 и методы микропроизводства для компартментализации6, включая метод синтеза бесклеточных белков (CFPS)7. Системы CFPS включают в себя основные клеточные механизмы для транскрипции и трансляции, обеспечивая основополагающую основу для разработки и интеграции многофункциональных искусственных клеток.

Несмотря на то, что методы CFPS часто используются при сборке синтетических элементов, разработка надежной и специализированной системы CFPS для сборки различных систем синтетических клеток остается сложной задачей. В настоящее время доступны многочисленные системы CFPS, полученные как от прокариот, так и от модельных организмовэукариот 8, каждая из которых специализируется на конкретных приложениях в синтезе синтетических клеток. Помимо своей центральной роли в транскрипции и переводе, системы CFPS различаются по своим основным компонентам и связанным с ними процедурам подготовки. Эти вариации, которые включают различия в клеточных экстрактах, РНК-полимеразах, методах подготовки матриц и буферных композициях, в значительной степени обусловлены различными траекториями развития, которые преследовали исследовательские группы, интенсивно оптимизировавшие свои системы для максимального выхода белка.

Среди различных компонентов системы CFPS экстракт клеток является критически важным ферментативным пулом для транскрипции и трансляции и, таким образом, ключевым фактором, определяющим эффективность CFPS9. CFPS на основе Escherichia coli (E. coli) является наиболее часто используемой системой из-за ее статуса наиболее изученного прокариотического организма. Кроме того, исследовательская группа Уэда разработала полностью восстановленную систему CFPS, состоящую из индивидуально очищенных белков и рибосом, известную как PURE10, которая особенно подходит для приложений, требующих четкого фона. В настоящее время даже системы CFPS на основе E. coli диверсифицированы, особенно с точки зрения исходных штаммов экстрак11 и методов получения12,13, РНК-полимеразы14,15, источников энергии16,17 и буферных систем18,19. К наиболее часто используемым штаммам относятся производные штаммов K12 и B, такие как A1920, JM10921, BL21 (DE3) 22 и Rossetta223, а также их генетически модифицированные аналоги.

Первоначально штаммы E. coli со сниженной активностью РНКазы и протеазы были выбраны для повышения стабильности мРНК и стабильности вновь синтезированных рекомбинантных белков, что привело к увеличению конечного выхода белка24. Впоследствии были разработаны экстракты E. coli для облегчения специфических посттрансляционных модификаций, включая гликозилирование25, фосфорилирование26 и липидирование27, которые были разработаны для достижения вышеупомянутых посттрансляционных модификаций. Кроме того, ряд добавок, таких как молекулярные шапероны28 и химические стабилизаторы, был включен для содействия сворачиванию целевых белков, способствуя диверсификации систем CFPS. РНК-полимераза бактериофага Т7, известная своей высокой технологичностью, преимущественно используется для транскрипции, хотя используются и другие полимеразы, такие как SP629. Эндогенная РНК-полимераза E. coli была адаптирована для прототипирования генетических цепей с использованием сигма-факторов30. Наконец, различные прекурсоры энергии 31,32,33 и различные соли и буферные компоненты 19,34,35 были систематически оптимизированы для повышения производительности.

Помимо самой системы CFPS, методы инкапсуляции, а также материалы для компартментализации также имеют жизненно важное значение для успешной сборки синтетических ячеек. Различные системы, которые были разработаны для успешной инкапсуляции реакции CFPS, включают стабилизированные поверхностно-активным веществом капли воды/масла, липиды/полимеры и их гибридные униламеллярные везикулы (диаметром от 50 нм до нескольких мкм), а также планарно-поддерживаемые липидные бислои. Однако, из-за содержания сложных молекул в системе CFPS, вероятность успеха инкапсуляции зависит от конкретных случаев, в частности, для образования везикул. Для повышения коэффициента успешности и эффективности инкапсуляции CFPS были разработаны различные микрофлюидные чипы, способствующие образованию как капель, так и везикул36. Тем не менее, необходимо будет установить дополнительные чипы и устройства.

Этот протокол описывает систему CFPS E. coli , использующую штамм BL21(DE3), который обычно используется в качестве хозяина для производства рекомбинантных белков. Протокол включает в себя подробный отчет о подготовке клеточного экстракта, подготовке матрицы и стандартной оптимизации экспрессии с использованием флуоресцентного репортерного белка. Кроме того, мы представляем примеры результатов, достигнутых путем инкапсуляции системы CFPS в различные микрокомпартменты, включая монослойные капли, двойные эмульсионные везикулы и камеры, расположенные поверх поддерживаемых липидных бислоев. Наконец, мы подробно останавливаемся на ключевых процедурных элементах и необходимых условиях, необходимых для успешного создания этих систем CFPS в различных экологических контекстах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Приготовление экстракта

  1. Разрежьте штамм E. coli BL21 (DE3) из глицеринового бульона на агаровую пластину Luria Bertani (LB) и инкубируйте не менее 15 часов при 37 °C.
  2. Приготовьте предкультуру на ночь, введя одну колонию из свежеприготовленной пластины LB в колбу объемом 50 мл среды Luria Bertani (LB).
  3. Внесите 5 мл предкультуры в 500 мл среды 2xYTPG в колбу Эрленмейера объемом 3 л. Выращивайте его при температуре 37 °C с энергичным встряхиванием (от 220 до 250 об/мин) и собирайте клетки, когда они достигают средней фазы логарифма (наружный диаметр600 ~ 3). Затем поместите клеточные культуры в холодную ледяную воду на 10 минут и центрифугируйте при 8000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе глюкоза в среде 2xYTPG может быть опущена для конкретных применений 9,12.
  4. Полученные клеточные гранулы ресуспендируют в 35 мл предварительно охлажденного буфера S30 A, а затем центрифугируют при 8000 × г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Повторите шаг 1.4 дважды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы ячеек можно хранить при температуре -80 °C, если не использовать их немедленно.
  6. Ресуспендируйте конечные гранулы в буфере S30 B (например, используйте 1,1 мл буфера S30 B на 1 г гранул ячейки) и разрушьте элементы за один проход через френч-пресс при давлении 17 000 фунтов на квадратный дюйм.
    1. Для использования френч-пресса следуйте руководству пользователя и перенесите суспензию ячеек в камеру разрушения металла френч-пресса, убедившись, что все компоненты собраны, а нижний клапан камеры разрушения закрыт.
    2. Перенесите собранную камеру разрушения на гидравлическую платформу и зафиксируйте предохранительный замок.
    3. Включите гидравлический насос и запустите сбой.
    4. Управляйте выпускным клапаном, чтобы суспензия элемента вытекала из выпускной трубки в новую трубку объемом 50 мл. Отрегулируйте скорость потока, чтобы обеспечить эффективное разрушение, в идеале по одной капле за раз. Поддерживайте давление выше нижнего предела в 15 000 фунтов на квадратный дюйм.
  7. Полученный лизат центрифугируют при 30 000 × г в течение 30 мин при 4 °C и собирают надосадочную жидкость. Повторите центрифугирование один раз и соберите надосадочную жидкость. Добавьте 0,3 объема прединкубационного буфера в собранную надосадочную жидкость и инкубируйте при осторожном встряхивании при температуре 37 °C в течение 80 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование прединкубационного буфера может увеличить конечный выход, хотя сообщалось, что пустой сток (без прединкубационного буфера) также может повысить эффективность37,38, которая зависит от соответствующего исходного штамма.
  8. Полученную смесь стекающих стоков в течение 2 ч сравнивают с 2 л буфера S30 C, один раз замените диализный буфер на 2 л свежего буфера S30 C и диализуйте в течение ночи при 4 °C39.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Второй этап ночного диализа может быть сокращен примерно до 3 часов.
  9. Соберите диализованный образец и центрифугируйте при давлении 30 000 × г в течение 30 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и аликвоту в соответствующие объемы и немедленно заморозьте в жидком азоте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженный образец можно хранить при температуре -80 °C не менее 6 месяцев до 1 года без потери эффективности.

2. РНК-полимераза Т7

  1. Преобразование плазмиды pAR1219 в BL21(DE3) звездообразные клетки E. coli 40.
  2. Инокулируйте 10 мл ночной культуры в 1 л LB среды (содержащей 100 мкг/мл ампициллина). Выращивайте клетки при 37 °C до тех пор, пока наружный диаметр600 не достигнет 0,6-0,8.
  3. Начните индукцию с добавления конечной концентрации 1 мМ IPTG. Индуцируйте клетки еще на 5 ч и соберите методом центрифугирования при 8 000 × г в течение 15 мин при 4 °C. Храните гранулы ячеек при температуре -80 °C до нескольких недель.
  4. Повторно суспендируйте клеточные гранулы в 30 мл буфера Т7 А и разрушьте клетки на один проход через френч-пресс при давлении 15 000 фунтов на квадратный дюйм. Удалите остатки клеток центрифугированием при температуре 20 000 × г в течение 30 минут при 4 °C.
  5. Добавляйте стрептомицина сульфат по каплям в надосадочную жидкость с предыдущего этапа, достигая конечной концентрации 4% (w/v). После короткой инкубации на льду центрифугируйте при 20 000 × г в течение 30 минут при 4 °C.
  6. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтрующую мембрану 0,45 мкм и загрузите отфильтрованный образец в прочную анионообменную колонку (объем колонки 40 мл), которая была предварительно уравновешена 10 объемами колонки буфера Т7 В, с помощью автоматизированной системы жидкостного хроматографа.
  7. Промыть загруженную колонку 50 объемами колонки буфера Т7 В и элюировать образец 10 объемами колонки смесей с низким содержанием солей (50 мМ NaCl) и высоким содержанием соли (500 мМ) Т7 буфера С, установив линейный градиент концентрации NaCl от 50 до 500 мМ при расходе ~3 мл/мин41.
  8. Соберите пиковые дроби и проанализируйте их с помощью SDS-PAGE.
    Примечание: Т7-полимераза проявляет преобладающую полосу при ~100 кДа, в то время как значительное количество примесей все еще присутствует на геле SDS-PAGE.
  9. Объедините фракции, содержащие Т7-полимеразу, и диализируйте против 2 л Т7-буфера С в течение ночи.
  10. Добавьте глицерин до достижения конечной концентрации 10% и концентрируйте полученную смесь до конечной концентрации 3-4 мг/мл с помощью ультрафильтрации42.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в процессе концентрирования появляются осадки, немедленно остановитесь и удалите осадки центрифугированием.
  11. Отрегулируйте концентрацию глицерина до 50%. Аликвотная и мгновенная заморозка образца с помощью жидкого азота. Хранить при температуре −80 °C в течение более длительного периода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшую аликвоту также можно хранить при температуре -20 °C не менее 1 месяца без потери эффективности.

3. Подготовка буфера

  1. Подготовьте буферы, как указано в таблице 1 , за день до использования.

4. Дизайн и подготовка шаблона

  1. Клонируйте интересующий ген в вектор на основе промотора Т7 или сгенерируйте линейный продукт ПЦР, содержащий интересующий ген.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Принципы проектирования см. в разделе обсуждений.
  2. Подготовьте плазмиду из ночной культуры с помощью набора для экстракции плазмид.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем выбирать набор плазмид, который включает в себя стадию осаждения изопропанола с последующей процедурой промывки 70% этанолом.
  3. Растворите высушенную ДНК в небольшом объеме сверхчистой воды до концентрации от 200 мкг/мл до 500 мкг/мл, определенной с помощью микрообъемного спектрофотометра.
  4. Дополнительно: Прямая экспрессия белков из продуктов линейной ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае необходима стадия очистки ПЦР.

5. Оптимизация Mg2+ и K+

  1. Приготовьте мастер-смесь для скрининга концентрации Mg2+ , как указано в таблице 2, или для скрининга концентрации K+ , как указано в таблице 3.
  2. Переложите мастер-смесь в отдельные микропробирки или V-образный 96-луночный планшет.
  3. Наберите точный объем стоковых растворов Mg2+ или K+ в отдельные микропробирки или V-образный 96-луночный планшет и завершите реакции CFPS сверхчистой водой. Инкубируйте реакции не менее 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете V-образную 96-луночную пластину, закройте пластину пластиковой крышкой, чтобы предотвратить испарение.
  4. Извлеките 2 мкл реакционной смеси и переложите в черный 96-луночный планшет для измерения флуоресценции с помощью планшетного ридера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем люминесцентный считыватель со следующей настройкой: возбуждение/излучение: 485/528, усиление: 50, высота считывания: 7,00 мм. Тем не менее, необходимо настроить считыватель пластин для создания определенной калибровочной кривой с использованием очищенных флуоресцентных белков.

6. Инкапсуляция

  1. Капелька
    1. Приготовьте фторсодержащее поверхностно-активное вещество масло (2% PFPE-PEG в HFE7500) или раствор липидно-минерального масла путем растворения липидов в минеральном масле (см. шаг 6.2.1)
    2. Приготовьте общий объем 100 мкл реакции CFPS, объединив соответствующие реагенты 2-18 из таблицы 4. Добавьте CFPS reaction к 500 мкл ранее приготовленного масла в пробирке объемом 1,5 мл, а затем энергично потрите пробирку о штатив для пробирок 50 раз, чтобы образовались мелкие капли (вода в масле). Инкубируйте пробирку при 30 °C, чтобы провести реакцию.
      Примечание: Простые микрофлюидные чипы также могут быть использованы для получения однородных капель43.
  2. Гигантские униламеллярные везикулы (ГУВ)
    1. Приготовление липидно-минерального масляного раствора
      1. Добавьте 57 мкл хлороформа в стеклянный флакон объемом 4 мл, а затем добавьте 18 мкл 25 мг/мл липидов 1-пальмитоил-2-олеоил-глицерол-3-фосфохолина (POPC) с образованием липидного раствора хлороформа, достигая конечной концентрации 8 мМ (используйте другие липиды с аналогичными конечными концентрациями).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап смешивания должен был обеспечить однородное смешивание различных липидов.
      2. Выпарить хлороформ под потоком аргона в течение 15 минут, а затем выпарить под вакуумом в течение 1 часа.
      3. Полученные сухие липиды растворить в 1500 μL минерального масла, доведя до конечной концентрации 400 μM. Инкубируйте смесь в течение ночи при комнатной температуре.
    2. Формирование межфазного липидного слоя
      1. Добавьте 500 мкл наружного раствора (см. Таблицу 5) в пробирку объемом 1,5 мл и медленно нанесите 250 мкл раствора липидно-минерального масла поверх наружного раствора. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут до образования стабильного межфазного липидного слоя.
    3. Приготовление внутреннего раствора
      1. Смешайте все реагенты, указанные в таблице 6 , чтобы получить раствор предварительного раствора, и держите его на льду до использования. Дополните внутренний раствор добавлением T7RNAP, экстракта S30 и матрицы ДНК в раствор предварителя в качестве реагентов 16-18, перечисленных в таблице 4.
        Примечание: Увеличение концентрации инкапсулированной сахарозы выше 250 мМ может ингибировать бесклеточную трансляцию44.
    4. Формирование GUV
      1. Добавьте 50 мл внутреннего раствора в новую пробирку объемом 1,5 мкл, содержащую 500 мл липидно-минерального масла, быстро пипетируйте вверх и вниз и энергично делайте вихри.
      2. Оставьте тюбик на льду на 10 минут и медленно добавьте 20 мкл эмульсионной смеси в верхнюю часть масляной фазы в 1,5 мл пробирки из шага 6.2.2.
      3. Центрифугируйте при давлении 800 × г (используйте скорость центрифугирования от 100 × г до 1000 × г) в течение 10 мин при 4 °C и наблюдайте за образованием GUV на дне пробирки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать более высокую удельную скорость центрифугирования; тем не менее, можно считать, что скорость центрифугирования может влиять на размер образующихся GUV45.
      4. Снимите верхнюю масляную фазу.
      5. Тщательно отсадите 30 μL GUVs на дно пробирки. Инкубируйте собранные GUV при 30 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура инкубации варьируется для разных белков.
      6. Используйте конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (LSM) для мониторинга экспрессии флуоресцентных белков.
  3. Поддерживаемый липидный бислой (SLB)
    1. Подготовка камер SLB
      1. Piranha-clean 24 x 24 мм #1.5 для покровных стекол путем добавления семи капель серной кислоты и двух капель 50% перекиси водорода в центр каждого покровного стекла. Инкубировать реагенты на покровных стеклах не менее 45 минут; Тщательно смойте ультрачистой водой.
      2. Соберите камеру восстановления, прикрепив отрезанную микропробирку объемом 0,5 мл к очищенным покровным стеклам с помощью оптического клея, отвержденного под ультрафиолетовой лампой (365 нм) в течение 10 минут, чтобы сформировать реакционную камеру.
    2. Образование SLB
      1. Растворите 80 моль 1,2-диолеоил-sn-глицерол-3-фосфохолин (DOPC), 19,95 моль 1,2-диолеол-sn-глицерол-3-фосфо-L-серин (DOPS) и 0,05 моль % Atto488-DOPE (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин = DOPE), смешайте с хлороформом, высушите под слабым потоком азота и вакуумируйте в течение 1 часа для полного удаления растворителя.
      2. Регидратируйте высушенную липидную пленку в буфере SLB A, в результате чего конечная концентрация липидов составляет 4 мг/мл.
      3. Сделайте вортекс и обработайте полученные образцы ультразвуком до тех пор, пока они не станут прозрачными.
      4. Разбавьте 4 мг/мл SUV со 130 мкл буфера А SLB, перенесите 75 мкл суспензии в предварительно сформированные реакционные камеры и инкубируйте ее на тепловом блоке при 37 °C в течение 1 мин. Добавьте 150 мкл буфера SLB A в реакционную камеру для дальнейшей инкубации в течение 2 мин.
      5. Промойте камеру 2 мл буфера SLB B (буфер SLB A без MgCl2) перед обменом буфера на буфер S30 C с 0,4% (w/v) BSA для реакций CFPS, оставив 100 мкл буфера внутри камеры, чтобы предотвратить высыхание образовавшегося SLB.
      6. Удалите остаточный буфер S30 C и осторожно добавьте реакционную смесь CFPS в камеру SLB. Инкубируйте камеру при температуре 30 °C и контролируйте экспрессию под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для каждой новой партии клеточного экстракта и РНК-полимеразы Т7 рекомендуется проводить базовый скрининг концентраций Mg2+ и K+ для обеспечения оптимальной производительности системы CFPS. Флуоресценция суперпапки GFP может служить индикатором общей произво...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В данной рукописи описывается модифицированная система синтеза бесклеточных белков (CFPS), предназначенная для использования в различных микрокомпартментах на синтетических клеточных платформах, включая капли воды в масле, GUV и SLB. Мы использовали стандартный штамм хо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.

Благодарности

M. Y. выражает благодарность за финансирование в рамках Программы последипломных исследований и практических инноваций провинции Цзянсу, Китай (Grant No. KYCX22_2803). Л.К. выражает благодарность за поддержку Естественнонаучным исследованиям высших учебных заведений провинции Цзянсу в Китае, Китай (грант No 17KJB180003), Фонда естественных наук Педагогического университета Цзянсу, Китай (грант No 17XLR037), Приоритетной академической программы развития высших учебных заведений провинции Цзянсу, Китай, и программы специально назначенного профессора Цзянсу, Китай.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)Avanti840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
50 mL tubesEppendorfEppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxideSigma-Aldrich516813
AcetateSigma-AldrichA6283
Agar powderSigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon Stirred CellsMerckMilliporeUFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininSigma-AldrichA4474
AsparaginSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
Baffled Erlenmeyer flaskShuniu250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)Roche10711454001
CentrifugetubeEppendorfEppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rackEppendorf0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging systemUvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10283
CoverslipThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)Roche10127566001
Creatine phosphate (CP)Sigma-Aldrich10621714001
Culture dishHuanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)aladdinC101487
Dialysis membraneSpectrumStandard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOmega Bio-TekD6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature CultivatorYiheng instrumentDHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)Biosharp1100027
Fluorescent plate readerBioTekSynergy 2
Fluorinated oilSuzhou CChip scientific instrument2%HFE7500
Folinic acidSigma-Aldrich47612
French PressG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlucoseSigma-AldrichG7021
GlutamatSigma-AldrichG5667
GlutaminSigma-AldrichG5792
GlycerolSigma-AldrichG5516
GlycinSigma-AldrichG7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
IsoleucinSigma-AldrichI5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
Magnesium chloride(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MethioninSigma-AldrichM8439
MicrocentrifugeEppendorf5424 R
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Multipurpose CentrifugeEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay MeasurementsIMPLENNanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene platesSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
PhenylalaninSigma-AldrichP8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Potassium Acetate(KOAc)Sigma-AldrichP5708
Potassium chloride(KCl)Sigma-AldrichP9541
Potassium glutamate (K-glutamate)Sigma-AldrichG1501
Potassium hydroxide(KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Pyruvate kinase (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
ShakerZhichushakersZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)Sigma-AldrichS5886
Sodium hydroxide(NaOH)Sigma-AldrichS5881
SucrosealaddinS112226
Sulfuric acidSigma-Aldrich339741
Syringe FiltersJinteng0.45 μm
Test tubeShuniu20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
TryptoneSigma-AldrichT7293
TryptophanSigma-AldrichT8941
TyrosinSigma-AldrichT8566
UTP Trisodium salt (UTP)aladdinU100365
Vacuum Pump with Circulated Water SystemZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-8150
ValinSigma-AldrichV4638
Vortex MixersKylin-BellVortex QL-861
Water purification systemMerckMilliporeDirect ultrapure water (Type 1)
Yeast extractSigma-Aldrich70161
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich444203

Ссылки

  1. Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
  2. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  3. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
  4. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187(2020).
  5. Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
  6. Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
  7. Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
  8. Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
  9. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663(2015).
  10. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  11. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  12. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882(2019).
  13. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
  14. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8(2010).
  15. Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045(2019).
  16. Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
  17. Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
  18. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
  19. Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
  20. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
  21. Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580(2023).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  24. Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
  25. Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686(2018).
  26. Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
  27. Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
  28. Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
  29. Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
  30. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  31. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
  32. Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
  33. Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
  34. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
  37. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
  38. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
  39. McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
  40. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  41. Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
  42. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  43. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
  44. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  45. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  46. Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637(2013).
  47. Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
  48. Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, Pt B 245-260 (2018).
  49. Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
  50. Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, Web Server issue W126-W131 (2007).
  51. RNAfold WebServer. Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna. , Available from: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi (2024).
  52. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495(2019).
  53. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
  54. Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
  55. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  56. Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

CFPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены