JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем методы индуцирования и анализа зависимого от обоняния ремоделирования синаптических клубочков антенной доли в ювенильном мозге дрозофилы .

Аннотация

Обонятельный сенсорный опыт в раннем возрасте вызывает драматическое ремоделирование синаптических клубочков в ювенильном мозге дрозофилы , которое эмпирически дозозависимо, ограничено во времени и временно обратимо только в короткий, четко определенный критический период. Направленность ремоделирования синаптических связей мозговой цепи определяется специфическим запахом, действующим на класс рецепторов-респондентов обонятельных сенсорных нейронов. В целом, каждый класс нейронов экспрессирует только один рецептор запаха и иннервирует один обонятельный синаптический клубок. В генетической модели дрозофилы полный массив обонятельных клубочков был точно отображен по реакции на запах и поведенческому выходу. Одорант этилбутирата (EB) активирует нейроны рецептора Or42a, иннервирующие клубочек VM7. В ранний критический период жизни опыт БЭ приводит к дозозависимой элиминации синапсов в обонятельных сенсорных нейронах Or42a. Временные периоды воздействия дозированного одоранта БЭ позволяют исследовать зависимое от опыта отсечение цепных связей в ювенильном мозге. Конфокальная микроскопия синаптических клубочков антенной доли проводится с помощью трансгенных маркеров, управляемых рецепторами Or42a, которые обеспечивают количественную оценку количества синапсов и объема иннервации. Сложный генетический инструментарий дрозофилы позволяет проводить систематическое препарирование клеточных и молекулярных механизмов, опосредующих ремоделирование мозговых цепей.

Введение

Ремоделирование ювенильных мозговых цепей в раннем возрасте представляет собой последний шанс для крупномасштабных изменений синаптических связей, чтобы соответствовать очень изменчивой, непредсказуемой среде, в которой рождается животное. Будучи наиболее многочисленной группой животных, насекомые разделяют этот эволюционно консервативный, основополагающий механизм ремоделирования критического периода1. Критические периоды открываются с началом сенсорного ввода, демонстрируют обратимые изменения контуров для оптимизации связности, а затем закрываются, когда силы стабилизации сопротивляются дальнейшемуремоделированию. Насекомые особенно зависимы от обонятельной сенсорной информации и демонстрируют четко определенный обонятельный критический период. Дрозофила представляет собой прекрасную генетическую модель для исследования этого зависимого от опыта критического периода в ювенильном мозге. Воздействие запаха в течение первых нескольких дней после эклозии приводит к изменению цепных связей в индивидуально идентифицированных синаптических клубочках 3,4. Направление ремоделирования зависит от конкретного входного одоранта. Некоторые одоранты вызывают увеличение объема синаптического клубочка в течение нескольких дней после эклозии (dpe)3,5,6,7, в то время как другие одоранты вызывают быструю элиминацию синапсов в течение критического периода 0-2 dpe, что приводит к снижению объема иннервации 8,9,10. В частности, опыт запаха этилбутирата (БЭ) приводит к дозозависимому синаптическому обрезанию нейронов обонятельных рецепторов Or42a только в этот критическийпериод раннего возраста8. Элиминация синапсов полностью обратима за счет модуляции поступления одоранта EB в течение критического периода, но становится постоянной после закрытия критического периода. Эта зависимая от обонятельного опыта синаптическая обрезка обеспечивает ценную экспериментальную систему для выяснения ограниченных во времени механизмов, лежащих в основе ремоделирования ювенильных цепей мозга.

Здесь мы представляем подробный протокол, используемый для индуцирования и анализа зависимого от опыта БЭ синаптического обрезания обонятельных сенсорных нейронов рецептора Or42a в течение критического периода раннего возраста. Мы показываем, что синаптические окончания Or42a в клубочке VM7 антенной доли могут быть специфически помечены путем трансгенного управления мембранно-привязанным маркером mCD8::GFP, либо непосредственно слитым с промотором Or42a (Or42a-mCD8::GFP)11, либо с использованием бинарной системы экспрессии Gal4/UAS (Or42a-Gal4 driving UAS-mCD8::GFP)12. Отдельные синапсы нейронов Or42a могут быть аналогичным образом помечены с использованием целевой трансгенной экспрессии маркеров пресинаптической активной зоны, объединенных в массив флуоресцентных меток (например, Bruchpilot::RFP)8, или электронно-плотного сигнала для ультраструктурного анализа синапсов (например, miniSOG-mCherry)8. Синаптические терминали Or42a могут быть визуализированы с помощью комбинации лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии. Мы показываем, что обрезка синаптических клубочков Or42a зависит от дозы БЭ, масштабируясь до концентрации временного воздействия одоранта. Процентное содержание одоранта EB, растворенного в минеральном масле, используемом в качестве транспортного средства, может варьироваться, как и продолжительность воздействия одоранта на животных на стадии развития. Наконец, мы показываем методы, используемые для анализа степени обрезки синаптических клубочков путем измерения интенсивности и объема иннервации VM7. Число синапсов также может быть количественно определено путем подсчета меченых синаптических точек и измерения параметров ультраструктуры синапсов с помощью просвечивающей электронной микроскопии8. В целом, показанный здесь протокол представляет собой мощный подход, который позволяет систематически препарировать как клеточные, так и молекулярные механизмы, опосредующие обрезку синаптической связи обонятельной цепи дрозофилы в ювенильный критический период. Описанная в этом исследовании общая установка воздействия запаха была использована в предыдущих исследованиях с использованием других запахов и анализом других клубочков 3,7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Воздействие одоранта

  1. С помощью тонкой кисти отсортируйте 40-50 животных на стадии развития в виде фаратных темных куколок (через 90+ ч после окукливания при 25 °C) в полистирольные флаконы дрозофилы размером 25 мм x 95 мм, содержащие стандартный корм из кукурузной патоки (рис. 1A).
  2. Поместите тонкую проволочную сетку из нержавеющей стали на концы флаконов дрозофилы , чтобы сдерживать мух и при этом обеспечивать хороший поток воздуха. Закрепите крышки из проволочной сетки с помощью прозрачной пленки на боковой стороне флаконов дрозофилы .
  3. В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл поместите 1 мл 100% минерального масла (управление транспортным средством) или растворите одорант этилбутирата (EB) в минеральном масле в другой пробирке для получения желаемой концентрации (например, 15% (150 μл) или 25% (250 μл)).
  4. Поместите пробирки для управления транспортным средством или микроцентрифуги с одорантом в вертикальном положении в герметичный контейнер Glasslock объемом 3700 мл. С помощью ленты надежно закрепите пробирки в центре камер с запахом вместе с флаконами дрозофилы (рис. 1B).
  5. Поместите герметичные камеры управления транспортным средством и одоранта EB, содержащие поэтапные флаконы с куколками фарата дрозофилы , во увлажненный (70%) инкубатор с регулируемой температурой (25 °C) в цикле свет/темнота 12 ч.
  6. Удалите только что закрытых мух через 4 часа после воздействия одоранта в камере и быстро пересадите 20-25 мух в свежие флаконы дрозофилы в камеры со свежеприготовленным одорантом (рис. 1A, B). Выбросьте незакрытые куколки.
  7. Держите мух в герметичных камерах с запахом в инкубаторах в общей сложности 24 часа. Для более длительного дозирования одоранта быстро пересаживайте мух в новые флаконы с дрозофилами в свежеизготовленных камерах одоранта каждые 24 часа.
  8. Обезболите мух на стадии развития, погрузив их в чашку с 70% этанолом на 1 минуту для подготовки к немедленной диссекции мозга и иммуноцитохимической обработке.

2. Диссекция головного мозга

  1. Маркируйте флаконы как контрольные (только 100% минеральное масло) или подверженные воздействию БЭ (% БЭ) с помощью маркировки и сохраняйте эти обозначения в течение всего времени вскрытия мозга и последующей обработки. Обработайте 10-20 животных для каждого генотипа/состояния запаха.
  2. С помощью щипцов перенесите одну муху под наркозом в маленькую миску со свежеприготовленным фосфатно-солевым буфером (PBS)13. Погрузите муху в PBS и продолжайте полное вскрытие мозга, полностью погрузив муху в воду.
  3. Тонкими (#1) заточенными щипцами обеими руками положите брюшную сторону мухи вверх и захватите верхнюю часть грудной клетки одним щипцом и головку под хоботком другими щипцами. Следите за тем, чтобы не проникнуть в мозг.
  4. Отделите голову от остальной части тела, осторожно потянув обеими руками в противоположных направлениях. Голова должна легко отделяться от грудной клетки; оставьте изолированную головку для вскрытия (рисунок 1C).
  5. Проденьте щипцы, ранее использовавшиеся для захвата грудной клетки, под противоположную сторону хоботка. Начните аккуратно оттягивать кутикулу экзоскелета в противоположные стороны, чтобы она разорвалась между глазами, чтобы раскрыть мозг.
  6. При вытягивании зрительные доли мозга могут отделяться вместе с экзоскелетом. Чтобы предотвратить это, используйте медленное, устойчивое потягивание двумя щипцами во время удаления кутикулы экзоскелета (Рисунок 1C, посередине).
  7. Продолжайте удалять кутикулу экзоскелета с головы. Убедитесь, что все части экзоскелета удалены. Удалите все ткани, прикрепленные к мозгу, включая жировое тело и выступающую трахею.
  8. Чтобы предотвратить прилипание, промойте наконечник пипетки P20 PBS + 0,2% Triton-X 100 (PBST). Сразу после вскрытия перенесите мозги в фиксирующий раствор (4% параформальдегид (PFA) + 4% сахароза) в закрытой пробирке (рис. 1C,D).

3. Иммуноцитохимия мозга

  1. Зафиксируйте мозг на 30 минут при комнатной температуре (RT) с вращением из конца в конец. Сохраняя мозг в трубке, отсоедините пипетку и правильно утилизируйте опасный фиксатор. Быстро промойте неподвижные мозги 3 раза с помощью PBS (Рисунок 1D).
  2. Мозги часто можно обнаружить застрявшими в колпачке трубок после вращения. Чтобы предотвратить случайную потерю мозга, которая является постоянной опасностью при всех переносах, используйте диссекционный микроскоп во время пипетирования жидкостей.
  3. При подготовке к мечению антителами блокируйте фиксированный мозг на 1 ч при ЛТ в PBST + 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) + 0,5% нормальной козьей сыворотки (NGS) с постоянным вращением конца за концом (рис. 1D).
  4. Удалите блок и инкубируйте мозг с выбранным первичным антителом, соответствующим образом разведенным в PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Инкубируйте мозг в течение ночи (14-16 ч) при температуре 4 °C при постоянном вращении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры использованных антител: крысиный анти-CadN (разведение 1:50)14 для мечения синаптических клубочков и куриный анти-GFP (1:1000)8 для мечения Or42a-mCD8::GFP (рис. 1D).
  5. Отведите пипетку от первичного антитела. Промойте мозги 3 раза по 20 минут каждый с PBST. Мозг инкубируют вторичными антителами, разведенными в PBST с 0,2% БСА + 0,1% NGS в течение 2 ч при ЛТ с постоянным вращением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно инкубировать мозг в течение ночи (14-16 часов) при температуре 4 °C. Разведите антитела в PBST с 0,2% BSA + 0,1% NGS; Здесь использованы вторичные антитела: 488 козьих анти-куриц (1:250) и 546 козьих анти-крыс (1:250).
  6. Отведите пипеткой вторичные антитела. Промойте мозги 3 раза по 20 минут каждый с PBST. В конце промойте мозги в течение 20 минут PBS (Рисунок 1D).
  7. Подготовьте предметные стекла для микроскопа (75 мм х 25 мм), добавив две тонкие полоски двустороннего скотча на предметное стекло на расстоянии ~25 мм друг от друга. Это обеспечивает спейсер, чтобы избежать раздавливания мозга.
  8. Пипетка ~10-15 мкл монтажной среды между двумя полосками ленты для крепления мозга. С помощью наконечника для пипетки P20, предварительно промытого PBST, перенесите помеченные мозги на предметное стекло микроскопа (рис. 1E).
  9. После того, как мозги будут перенесены, используйте тонкую кисть, чтобы выровнять их, убедившись, что доли антенн обращены вверх. Ищите сторону, которая имеет изогнутый горб, в котором будут находиться доли усиков.
  10. После того, как мозг будет правильно сориентирован, накройте его стеклянным покровным стеклом (No 1.5H), убедившись, что покровное стекло надежно закреплено на ленте. Затем заполните боковые стороны покровного стекла дополнительным монтажным материалом (Рисунок 1E).
  11. Заклейте края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей. Дайте предметному стеклу полностью высохнуть, а затем храните его в холодильнике для последующей визуализации.

4. Конфокальная визуализация

  1. Ослепите все слайды мозга в отношении генотипа и состояний опыта до получения изображений, пометив слайд закодированной меткой для последующей расшифровки.
  2. Используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с 63-кратным масляным иммерсионным объективом. На всех изображениях, показанных здесь, мы используем микроскоп Zeiss 510 META (рис. 1F).
  3. Используйте соответствующие лазерные линии для используемых флуорофоров. Здесь используется лазер Argon 488 и HeNe 543 для визуализации синаптических клубочков антенной доли и обонятельных сенсорных нейронов Or42a (Рисунок 2).
  4. Определите оптимальное усиление и смещение для обоих каналов, в идеале сохраняя усиление для обоих каналов <750 и смещение ≈0. Это сделано для того, чтобы обеспечить оптимальное соотношение сигнал/шум при ограничении фона.
  5. Расположите визуализацию к центру мозга. При визуализации клубочки VM7 располагаются проксимально к отверстию, оставшемуся в середине мозга после удаления пищевода во время диссекции (рис. 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клубочки VM7 всегда будут находиться близко к отверстию пищевода. Тем не менее, точное местоположение и размер немного варьируются в зависимости от различий в рассечении мозга и креплении, поэтому учитывайте это при визуализации.
  6. Выберите разрешение изображения и толщину оптического среза. Здесь используется разрешение 1024 x 1024 с толщиной среза Z-стека 0,37 мкм.
  7. Проведите всю конфокальную проекцию Z-стека через антенную долю, обеспечив захват полной иннервации нейронов Or42a клубочков VM7.

5. Синаптические измерения

  1. Загрузите слепое изображение генотипа/состояния в Fiji (1.54f). Разделите каналы лазерной линии, нажав «Изображение» > «Цвет» > «Разделить каналы».
  2. В обонятельном сенсорном канале Or42a определите, какие срезы содержат иннервацию Or42a, прокручивая весь Z-стек и определяя, где начинается и заканчивается флуоресценция.
  3. Создайте проекцию суммарных срезов, включающую только срезы, содержащие иннервацию нейронов Or42a, щелкнув Image > Stacks > Z Project > Sum Slices и введя нужный диапазон.
  4. На Фиджи нажмите на инструмент «Лассо » на верхней панели, чтобы проследить контур иннервации нейрона Or42a в клубочке VM7, обрабатывая каждую сторону мозгового клубочка независимо (рис. 3).
  5. Умножьте длину окружности на количество срезов Z-стека и толщину каждого среза, чтобы получить объем иннервации синаптического клубочка VM7. Для количественной оценки числа синапсов можно использовать инструмент find maxima вместе с макросом find maxima stacks для подсчета точек синапса в очерченной области 8,15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1 показан рабочий процесс для обонятельного опыта, критического периода, воздействия запаха и методов визуализации мозга. Протокол начинается с сопоставления возраста фаратных темных куколок непосредственно перед экслозией (ри...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представленный здесь протокол воздействия одорантов и визуализации мозга может быть использован для надежного индуцирования и количественной оценки зависимой от опыта обрезки синаптических клубочков обонятельных сенсорных нейронов в ранний критический период жи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим других членов Broadie Lab за их ценный вклад. Фигуры создавались с использованием BioRender.com. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения MH084989 и NS131557 К.Б.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
For Odor Exposure
Drosophila vialsGenesee Scientific32-110
Ethyl butyrateSigma AldrichE15701
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Mineral oilSigma AldrichM3516
Odor chambersGlasslock
Paint brushesWinsor & NewtonSeries 233
ParafilmThermofisherS37440
Wire meshScienceware378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proofDecon Labs2801Diluted to 70%
ForcepsFine Science Tools11251-30Dumont #5
Paraformaldehyde Electron Microscope Sciences157-8Diluted to 4%
Petri dishesFisher Scientific 08-757-100B
Phosphate-buffered salineThermo Fisher Scientific70011-044Diluted to 1x
SucroseFisher Scientific BP220-1
SylgardElectron Microscope Sciences24236-10
Triton-X 100Fisher Scientific BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chickenInvitrogenA11039
546 goat anti-ratInvitrogenA11081
Bovine serum albumin Sigma AldrichA9647
Chicken anti-GFPAbcam13970
CoverslipsAvantor48366-06725 x 25 mm
Double-sided tapeScotch34-8724-5228-8
Fluoromount-G Electron Microscope Sciences17984-25
Microscope slidesFisher Scientific12-544-275 x 25 mm
Nail polishSally Hansen109Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serumSigma AldrichG9023
Rat anti-CadNDevelopmental Studies Hybridoma BankAB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscopeCarl ZeissZeiss 510 META 
Fiji softwareFijiVersion 2.14.0/1.54f

Ссылки

  1. English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
  2. Fabian, B., Sachse, S. Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects. Fron Cell Neurosci. 17, 1130091(2023).
  3. Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
  4. Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age. J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).
  5. Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).
  6. Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).
  7. Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit. PLoS Genet. 11 (5), e1005244(2015).
  8. Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).
  9. Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).
  10. Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe. J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).
  11. Stephan, D., et al. Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms. J Neurosci. 32 (46), 16080(2012).
  12. Doll, C. A., Broadie, K. Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory. Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).
  13. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. J Vis Exp. (118), e55128(2016).
  14. Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos. Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance. Nat Comm. 12 (1), 1160(2021).
  17. Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing. eLife. 12, 85443(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

OR42a

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены