Внутрикамерная инъекция крысам с низким риском побочных эффектов

Резюме

Этот протокол описывает технику внутрикамерной инъекции крысам с использованием центрального разреза роговицы и длинного туннеля в переднюю камеру. Этот метод инъекции сводит к минимуму риск непреднамеренного повреждения тканей и тем самым повышает точность и воспроизводимость.

Аннотация

Внутрикамерная инъекция является стандартной процедурой введения в офтальмологии. Применение внутрикамерной инъекции у грызунов для исследований является сложной задачей из-за предельных размеров и анатомии глаза, включая небольшой объем водянистой влаги, кривизну хрусталика и толщину хрусталика. Потенциальное повреждение во время внутрикамерных инъекций приводит к неблагоприятным последствиям и экспериментальной вариабельности. Этот протокол описывает процедуру внутрикамерной инъекции крысам, обеспечивающую точность и воспроизводимость.

В качестве экспериментальных моделей использовались крысы Спрэг-Доули. Поскольку положение хрусталика у крыс выступает в переднюю камеру, введение с периферии, как это делается у человека, неблагоприятно. Таким образом, разрез создается в центральной области роговицы с помощью лезвия шпильки 31 калибра 0,8 мм, чтобы сформировать самогерметизирующийся туннель в переднюю камеру. Разрез под углом, близким к плоскому, позволяет создать длинный тоннель, что сводит к минимуму потерю водянистой влаги и обмеление передней камеры. Наноигла 34 калибра вводится в туннель для инъекции. Это обеспечивает проникновение с минимальным сопротивлением трению и позволяет избежать прикосновения к объективу. Введение трипан-синего позволяет визуализировать с помощью щелевой микроскопии наличие красителя в передней камере и исключить утечку. Биодоступность к эндотелиальному слою роговицы демонстрируется при введении красителя Hoechst, которым окрашиваются ядра эндотелиальных клеток роговицы после инъекции.

В заключение следует отметить, что в этом протоколе реализована процедура точной внутрикамерной инъекции крысам. Эта процедура может быть использована для внутрикамерной доставки различных лекарственных препаратов и соединений в экспериментальных моделях крыс, повышая эффективность и воспроизводимость офтальмологических исследований.

Введение

Биодоступность соединений, доставляемых при местном введении на поверхность глаза, сильно ограничена и обычно составляет <5%¹. Соединения, вводимые глазными каплями, в основном устраняются за счет дренажа, индуцированного слезотечения, оборота слезной жидкости и всасывания конъюнктивы. Кроме того, проникновение соединений через поверхность глаза сильно ограничено роговично-конъюнктивным барьером ^1,2,3. Роговица состоит из трех основных слоев: самого наружного эпителия, промежуточной стромы и самого внутреннего эндотелия. Поверхностный эпителий роговицы связан между собой прочными плотными соединениями и создает высокую парацеллюлярную резистентность, которая является основным барьером для проницаемости вещества. Множественные слои эпителия еще больше ограничивают проникновение гидрофильных и крупных молекул через межклеточные пространства эпителия роговицы. Следуя за эпителием, строма состоит из коллагеновых волокон и содержит водные поры. В отличие от эпителия роговицы, строма позволяет перемещаться гидрофильным препаратам; Однако он сильно непроницаем для липофильных соединений ^1,2,3. Вместе эпителий роговицы и стромальные слои представляют собой основные тканевые барьеры, ограничивающие абсорбцию лекарственного средства. Считается, что эндотелий роговицы не ограничивает транспортировку лекарств.

Альтернативой роговичному пути доставки является конъюнктивальный путь. Конъюнктива представляет собой многоэпителиальный слой, который покрывает внутреннюю сторону век и переднюю часть склеры. Конъюнктива характеризуется меньшим количеством узких соединений, чем эпителий роговицы, что обеспечивает лучшую проницаемость гидрофильных препаратов. Однако васкуляризация конъюнктивы приводит к системной абсорбции большой фракции вводимых молекул, что также сильно ограничивает биодоступность доставляемых соединений в переднюю камеру ^1,2. Эффективным способом обхода внешних барьеров проницаемости глаза является доставка препарата непосредственно в интересующую область. Например, интравитреальное введение является обычным для введения в стекловидное тело⁴. Аналогичным образом, внутрикамерная инъекция используется для доставки в переднюю камеру⁵. Установление эффективной концентрации в передней камере имеет решающее значение в различных клинических ситуациях, таких как лечение инфекции путем внутрикамерного введения антибиотиков и послеоперационное противовоспалительное лечение при операциях по удалению катаракты. Несмотря на преимущество улучшенной биодоступности вещества, обеспечиваемого внутрикамерным введением, существуют серьезные проблемы безопасности, которые следует учитывать. Например, внутрикамерное введение препарата может вызвать повышение внутриглазного давления, синдром токсического переднего сегмента и синдром токсического разрушения эндотелиальных клеток ^5,6. Поэтому в доклинических исследованиях важно тщательно оценивать эффективность и безопасность лекарственных препаратов, вводимых в виде внутрикамерных инъекций, чтобы максимизировать эффективность лечения и свести к минимуму потенциальные побочные эффекты у пациентов.

Экспериментальные модели на животных незаменимы в доклинических исследованиях для изучения новых методов лечения. Мелкие грызуны, такие как мыши и крысы, являются наиболее часто используемыми лабораторными животными для таких целей. Эти животные демонстрируют множество сходств с анатомией и физиологией человека, предоставляя ценные сведения. Кроме того, их использование экономически выгодно благодаря небольшим размерам, простоте в уходе, быстрой беременности и способности производить большое^{количество} потомства7.

Несмотря на широкое использование мелких грызунов в моделях глазных заболеваний, их уникальные размеры глаз и анатомия создают значительные проблемы при проведении экспериментальных манипуляций. Например, такие процедуры, как внутрикамерные инъекции, которые относительно просты у людей, становятся технически сложными у мышей и крыс. Проблемы возникают из-за таких факторов, как небольшой объем водянистой влаги, относительно большой и негибкий хрусталик, а также обструктивное расположение и кривизна хрусталика в глазах грызунов (рис. ^1). Эти проблемы увеличивают риск повреждения во время внутрикамерных инъекций у грызунов, что приводит к потенциальным неблагоприятным эффектам и вносит экспериментальную вариабельность, которая может повлиять на достоверность выводов исследования. В наших исследованиях мы успешно разработали процедуру безопасной внутрикамерной инъекции крысам. Этот метод включает в себя создание длинного, плоского, самогерметизирующегося туннеля в роговице в переднюю камеру. Этот метод не только обеспечивает точность, но и повышает воспроизводимость экспериментов, решая проблемы, связанные с методами инъекций у мелких грызунов.

Рисунок 1: Схематическое изображение анатомических особенностей переднего сегмента глаз крысы и человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

Эксперименты в протоколе были одобрены Национальным комитетом по выдаче разрешений - для зоотехнии и соответствуют Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Для настоящего исследования были использованы самки крыс Sprague-Dawley в возрасте 8-10 недель, которые подвергались 12-12-часовому циклу «свет-темнота». Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка животных

1. Приготовьте смесь анестетика из кетамина (80 мг/кг массы тела в 0,8 мл) и ксилазина (4 мг/кг массы тела в 0,2 мл) и введите ее внутрибрюшинно за одну инъекцию для обезболивания крыс.
2. Вводите анальгетик бупренорфин (0,03 мг/кг) внутрибрюшинно за одну инъекцию.
3. Нанесите местный офтальмотерапевтический анестетик 0,4% оксибупрокаин на оба глаза.

2. Создание самогерметизирующегося роговичного тоннеля

1. Стабилизируйте глаз, удерживая верхнюю склеру по вертикальной средней линии рядом с корнеосклеральным соединением с помощью хирургических офтальмологических щипцов.
2. Под хирургическим микроскопом поместите стерильное лезвие шпильки 0,8 мм и плотностью 31 G в парацентральную область роговицы по вертикальной средней линии (над центром зрачка) в плоском положении под углом, максимально приближенным к горизонтальному (рис. 2).
3. В таком положении проколите роговицу, чтобы сделать разрез и создать длинный тоннель (2-3 мм) до тех пор, пока он не проникнет в центральную область передней камеры. Не прикасайтесь к объективу (Рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Успешный туннель не вызовет утечки водянистой влаги и обмеления передней камеры.
4. Нанесите внутрь внутрь глаз 0,3% офлоксацина и 0,1% дексаметазона.
5. Исследовать под щелевой микроскопией можно следующим образом.
   1. Наблюдайте за глубиной передней камеры инъецируемого глаза по сравнению с неинъекционным глазом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина должна быть аналогичной.
   2. Посмотрите на хрусталик инъекционного глаза по сравнению с неинъекционным глазом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив должен быть прозрачным. Помутнение может отражать повреждение хрусталика во время хирургической процедуры.

Рисунок 2: Схематическое изображение угла и положения лезвия и разреза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Вариант 1: Внутрикамерное введение трипанового синего для оценки успешности инъекции в переднюю камеру

1. Загрузите 5 μL трипанового синего в стерильный стеклянный шприц Hamilton объемом 10 μL с тупой иглой 34 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция трипанового синего описывается как средство оценки успешности инъекции на этапах калибровки или настройки модели. В экспериментальных условиях шприц может быть загружен раствором выбранного соединения.
2. Введите заряженную иглу шприца через туннель, созданный в разделе 2, в переднюю камеру.
3. Введите и удерживайте иглу на месте после инъекции в течение 2-3 секунд, пока вся жидкость не исчезнет.
4. Извлеките иглу, осторожно и медленно вытащив ее, чтобы избежать утечки из роговичного канала.
5. Исследуйте под щелевой микроскопией. Оцените глубину залегания передней камеры, чтобы исключить обмеление и проверьте наличие трипанового синего в передней камере.
6. Повторное исследование через 24 ч, 48 ч и 72 ч.

4. Вариант 2: Внутрикамерное введение Хёхста для оценки биодоступности вводимого материала в слой эндотелиальных клеток

1. Загрузите 5 μL Hoechst в стерильный стеклянный шприц Hamilton объемом 10 μL с тупой иглой 34 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция Хёхста описывается как средство оценки биодоступности вводимого материала путем поглощения в слой эндотелиальных клеток и полезна на этапах калибровки или настройки модели. В экспериментальных условиях шприц может быть загружен раствором выбранного соединения.
2. Введите заряженную иглу шприца через туннель, созданный в разделе 2, в переднюю камеру.
3. Введите и удерживайте иглу на месте после инъекции в течение 2-3 секунд, пока вся жидкость не исчезнет.
4. Извлеките иглу, осторожно и медленно вытащив ее, чтобы избежать утечки из разреза роговичного канала.
5. Примерно через 15-20 минут после инъекции усыпьте крыс путем внутрибрюшинного введения 500 мг/кг пентобарбитала натрия.
6. Энуклеируйте оба глаза и изолируйте роговицу. Соберите неинъекционную роговицу в качестве контроля.
7. Окрашивайте обе роговицы 0,5% Ализарин Ред S в соответствии с инструкциями производителя для выявления эндотелиальных клеток.
8. Исследуйте под световым микроскопом, чтобы получить изображение ализариново-красного окрашивания эндотелиальных клеток, и под флуоресцентным микроскопом, чтобы наблюдать окрашивание по методу Хёхста, по сравнению с неинъецированной роговицей в качестве контроля.

Результаты

Крысам Sprague Dawley вводили интракамерально 5 мкл трипанового синего в соответствии с протоколом, описанным выше. Осмотр с помощью щелевой лампы сразу после инъекции показал, что камера окрашена трипановым синим, что указывает на то, что введенный материал достиг передней...

Обсуждение

Модели доклинических исследований должны обеспечивать контролируемую и воспроизводимую среду для обеспечения надежности и применимости результатов. В офтальмологических исследованиях модели глазных инъекций обычно используются в различных исследовательских ас?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin Red	Alpha Aesar	042040.5
Buprenorphine	Richter pharma	102047
Dexamethasone 0.1%	Fisher Pharmaceutical	393102-0413
Hamilton glass syringe 10 μL	Hamilton Co.	721711
Hoeschst	Merck	B2261
Ketamine	Bremer pharma GMBH (medimarket)	17889
Ofloxacin 0.3% eye drops	Allergan	E92170
Oxybuprocaine Hydrochloride 0.4%	Fisher Pharmaceutical	N/A
Pentobarbital sodium 200 mg/mL	CTS	N/A
Slit microscope	Haag-streit bern	b-90019115
Sprague-Dawley Rats	Envigo	N/A
Stiletto blade 31 G 0.8 mm	Tecfen medical (skymed)	QKN2808
Surgical microscope	Zeiss	OPMI-6 CFC
Trypan Blue	Sartorius	03-102-1B
Xylazine	Eurovet Animal Health	615648