Подготовка и анализ гистологических стекол глазных яблок крыс и мышей для оценки сетчатки глаза

Резюме

В данной рукописи представлен протокол гистологической подготовки предметных стекол из глазных яблок грызунов. С помощью предложенного метода внутреннюю часть сетчатки можно легко визуализировать и оценить под световым микроскопом. Процедура представлена для глазных яблок мышей и крыс.

Аннотация

Глазное яблоко грызунов является мощным инструментом для исследования патомеханизмов многих офтальмологических заболеваний, таких как глаукома, гипертоническая ретинопатия и многих других. Доклинические эксперименты позволяют исследователям изучить эффективность новых лекарств, разработать новые методы лечения или найти новые патомеханизмы, участвующие в возникновении или прогрессировании заболевания. Гистологическое исследование дает много информации, необходимой для оценки эффектов проведенных экспериментов, и может выявить дегенерацию, ремоделирование тканей, инфильтрацию и многие другие патологии. В клинических исследованиях редко есть шанс получить ткань глаза, пригодную для гистологического исследования, поэтому исследователям следует воспользоваться возможностью, предоставляемой исследованием глазных яблок грызунов. В данной рукописи представлен протокол гистологической подготовки срезов глазных яблок грызунов. Методика представлена для глазных яблок мышей и крыс и включает в себя следующие этапы: (i) забор глазного яблока, (ii) сохранение глазного яблока для дальнейшего анализа, (iii) обработка ткани парафином, (iv) подготовка предметных стекол, (v) окрашивание гематоксилином и эозином, (vi) оценка ткани под световым микроскопом. С помощью предложенного метода можно легко визуализировать сетчатку глаза и детально ее оценить.

Введение

Глазное яблоко представляет собой шарообразную структуру, составляющую орган зрения. Внутреннюю часть глазного яблока можно разделить на два сегмента: передний сегмент, который включает в себя роговицу, радужную оболочку, цилиарное тело, хрусталик, переднюю камеру и заднюю камеру, и задний сегмент, который включает в себя стекловидное тело, сетчатку, сосудистую оболочку, склеру, корешок зрительного нерва. Передняя камера расположена между роговицей и радужной оболочкой ^1,2. Радужная оболочка представляет собой круглую структуру с отверстием в центре, называемым зрачком. На стыке роговицы и радужной оболочки находится дренажный угол, где специализированная система трабекул отводит водистую влагу от глазного яблока к венозной системе. Задняя камера ограничена радужной оболочкой, цилиарным телом и хрусталиком, а также подвешивающими связками, которые удерживают хрусталик на месте. За хрусталиком находится стекловидное тело, которое является самой большой структурой глазного яблока. Стекловидное тело прилегает к сетчатке и стабилизирует ее положение. Сетчатка окружена сосудистой оболочкой и склерой¹. Анатомия глазного яблока представлена на рисунке 1.

Стенка глазного яблока состоит из трех слоев. Самым внешним слоем является склера, которая защищает глазное яблоко от травм и сохраняет его форму. На переднем полюсе глазного яблока склера превращается в прозрачную роговицу. Под склерой находится сосудистая структура, называемая увеакой, основной функцией которой является питание структур глаза. Язычковая оболочка образует сосудистую оболочку, а в пределах переднего полюса — цилиарное тело и радужную оболочку¹. Самым внутренним слоем является сетчатка, которая представляет собой узкоспециализированную структуру глаза, состоящую из нейронов, глиальных клеток и клеток пигментного эпителия. Нейроны сетчатки включают фоторецепторные клетки (палочки и колбочки), горизонтальные клетки, биполярные клетки, амакриновые клетки и ганглиозные клетки сетчатки (РГК). Эти клетки организованы в сложные слои, и их роль заключается в получении и обработке световых стимулов ^2,3. Глиальные клетки сетчатки состоят из клеток Мюллера, астроцитов и микроглии, которые присутствуют во всех слоях сетчатки. Многие функции глиальных клеток включают питание нейронов, поддержку гемато-сетчатчатого барьера, структурную поддержку нейронов для поддержания слоистой структуры сетчатки, регуляцию метаболизма нейронов, секрецию биологически активных белков, регулирующих функционирование, рост и выживание нейронов, а также регуляцию иммунологических процессов в сетчатке⁴. Клетки пигментного эпителия составляют самый внешний слой сетчатки и действуют как барьер между сосудистой оболочкой и фоторецепторами. Эти клетки регулируют двунаправленный транспорт продуктов жизнедеятельности и питательных веществ, а также защищают сетчатку от чрезмерного повреждения, вызванного светом, поглощая световую энергию и нейтрализуя генерируемые светом активные формы кислорода⁵.

Сетчатку можно разделить на десять слоев: (i) пигментный эпителий сетчатки, (ii) слой сегмента фоторецептора (палочки и колбочки), (iii) внешняя пограничная мембрана (ELM), (iv) внешний ядерный слой (ONL), (v) внешний плексиформный слой (OPL), (vi) внутренний ядерный слой (INL), (vii) внутренний плексиформный слой (IPL), (viii) слой ганглиозных клеток (GCL), (ix) слой нервных волокон сетчатки (RNFL), и (x) внутренняя пограничная мембрана (ILM)². Ядрообразные слои сетчатки включают ONL, INL и GCL, в то время как слои с синаптическими связями между клетками включают OPL и IPL⁶. Ядра палочек и колбочек образуют ONL, а их аксоны простираются в OPL, где соединяются с дендритами биполярных и горизонтальных клеток. В пределах INL расположены ядра горизонтальной, биполярной и амакриновой клеток. В пределах IPL окончания аксонов биполярных и амакриновых клеток синапс с дендритами РГК. В пределах GCL RGC составляют большую часть клеточных тел, но также там могут быть обнаружены некоторые смещенные амакриновые клетки. Аксоны РГК образуют РНФЛ и, далее - зрительный нерв ^7,8,9.

Многие офтальмологические заболевания, такие как нейродегенеративные заболевания сетчатки, приводят к необратимой и неизлечимой^{слепоте 10}. Зрение считается одним из важнейших органов чувств, и постоянная слепота значительно снижает качество жизни пациента. Для углубления понимания патомеханизмов многих заболеваний широко проводятся доклинические исследования с использованием клеточных культур или животных моделей. Доклинические исследования на экспериментальных животных дают возможность оценить патомеханизмы глазных заболеваний и разработать новые терапевтические стратегии. Заболевания глаз можно моделировать как у крупных животных (обезьян, коров, собак и кошек), так и у мелких животных (кроликов, крыс, мышей и рыбок данио). Использование более крупных животных обеспечивает лучший доступ к глазу благодаря его размерам. Эксперименты, проведенные с грызунами, с другой стороны, благодаря их относительно быстрому размножению, позволяют выводить инбредные штаммы, характеризующиеся восприимчивостью к некоторым заболеваниям^12,13.

На животных моделях возможна энуклеация, которая позволяет провести детальное гистопатологическое исследование глазного яблока, с оценкой незначительных патологий, которые появляются в тех или иных структурах глаза в процессе развития заболевания – обследование, которое может быть выполнено очень редко у человека. Гистопатологическая оценка является чрезвычайно ценным инструментом при исследовании патомеханизмов глазных заболеваний. В опубликованной литературе описания методики гистологического исследования глазных яблок весьма ограничены, а также отсутствуют пошаговые руководства, что затрудняет воссоздание для новичков. Данное исследование направлено на то, чтобы предложить простой и лаконичный метод подготовки гистологических препаратов и оценки сетчатки глаза крысы и мыши.

протокол

Исследование проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями. Глазные яблоки, использованные в этом исследовании, были получены от животных, включенных в эксперимент, проведенный на основании номера одобрения исследования WAW2/122/2020, выданного^2-м местным комитетом по этике Варшавского университета естественных наук в Варшаве, Польша. Наш протокол был разработан путем обследования мышей в возрасте 11 и 44 недель и крыс в возрасте 6, 12 и 16 недель.

1. Подготовка глазных яблок мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол представляет собой метод подготовки срезов глазных яблок мышей и был разработан с использованием глазных яблок, полученных от: самок мышей C57Bl/6 в возрасте 11 недель (средний вес 21 г), самок мышей C57Bl/6 в возрасте 44 недель (средний вес 25 г), самок мышей DBA/2 в возрасте 11 недель (средний вес 21,5 г) и самок мышей DBA/2 в возрасте 44 недель с глаукомой (средний вес 25 г).

1. Энуклеация
   1. Используйте небольшие щипцы, чтобы открыть веки. Надавите на веки, чтобы глазное яблоко выпало.
   2. Рассеките глазное яблоко от глазницы, отрезав ткань за глазным яблоком маленькими острыми ножницами. Как только глазное яблоко будет удалено из орбиты, отрежьте выступающую соединительную ткань и окологлазные мышцы.
      1. Отметьте глазные яблоки для лучшей ориентации, например, завязав небольшой шов на культе сухожилия латеральной прямой мышцы глазного яблока, чтобы отметить височную сторону глазного яблока.
2. Фиксация тканей
   1. Поместите энуклеированное глазное яблоко в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и дайте ему отдохнуть в 4 % растворе параформальдегида (PFA), растворенном в фосфатном буферном растворе (PBS), в течение 24 ч.
   2. После этого обрабатывают глазное яблоко в течение 24 ч в 10% растворе сахарозы, затем удаляют и помещают его на 24 ч в 20% раствор сахарозы, и, наконец, извлекают и помещают на 24 ч в 30% раствор сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего процесса держите глазное яблоко при низкой температуре 4 °C. Следует избегать проколов иглой для инфильтрации сахарозы, чтобы свести к минимуму риск повреждения глазного яблока.
3. Замораживание и хранение тканей
   1. Извлеките глазное яблоко из раствора сахарозы и высушите его, слегка промокнув бумажным полотенцем.
   2. Поместите глазное яблоко в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и заморозьте при температуре -80 °C для дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении при температуре -80 °C глазное яблоко может оставаться жизнеспособным до 12 месяцев до дальнейшей обработки.
4. Подготовка предметного стекла
   1. Разморозьте глазное яблоко при комнатной температуре. Переместите его из микроцентрифужной пробирки в кассету и промойте под проточной водой в течение 20 минут, чтобы вымыть сахарозу.
   2. Обезвожьте глазное яблоко, поместив его в вытяжной шкаф, а затем извлеките из него следующие растворы: 70% раствор этилового спирта (EtOH) на 10 мин, 80% раствор EtOH на 10 мин, 96 % раствор EtOH на 10 мин, 99,9 % раствор EtOH на 10 мин и ацетон на 5 мин.
   3. Очистите глазное яблоко, поместив его в ксилол на 5 минут под вытяжной шкаф.
   4. Растопите парафин, поместив немного твердого парафина в стакан и поместив его в лабораторный инкубатор, установленный на температуру выше температуры плавления, указанной производителем парафина (температура плавления парафина составляет от 46 °C до 68 °C). После того как парафин полностью растает (время зависит от количества использованного парафина), переместите глазное яблоко в стакан с парафином и держите в тепле в инкубаторе 1 ч. В течение 1 часа инфильтрации парафина в ткани перемешивайте парафин каждые 10 - 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа можно использовать тканевый процессор, который обеспечивает инфильтрацию парафина во время перемешивания раствора.
   5. Вставьте глазное яблоко в парафиновый блок, как описано ниже.
      1. Откройте кассету и снимите верхнюю крышку. Выберите металлическую форму и налейте небольшое количество парафина, чтобы покрыть дно формы. Извлеките глазное яблоко из кассеты с помощью щипцов и поместите его на парафин в форму. Положите глазное яблоко на бок, чтобы обеспечить разрез в сагиттальной плоскости.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение глазного яблока на боку (с передним полюсом с одной стороны и задним полюсом с другой) позволит выполнить разрез в сагиттальной плоскости. Таким образом, будут получены срезы роговицы, радужной оболочки, цилиарного тела, зрачка, периферической и центральной сетчатки.
      2. Кратковременно охладите форму на охлаждающей пластине, установленной на -15 °C, чтобы парафин слегка застыл и закрепил ткань на месте. Тщательно накройте ткань парафином и кассетное дно, чтобы образовался блок. Положите блок на охлаждающую пластину для полного застывания. Затем извлеките блок из металлической формы и поместите парафиновые блоки обратно на охлаждающую пластину не менее чем на 15 минут, чтобы они остыли перед резкой.
   6. Закрепите парафиновый блок в микротоме. Устанавливаем микротом, чтобы обрезать излишки парафина с блока (ставим его на срез 15 мкм) и обрезаем до центра глазного яблока. Изменяем настройки микротома, чтобы вырезать более тонкие секции (мы устанавливаем его на 3,5 мкм) и помещаем секцию на слайд. Если вы используете микротом с прилегающей водяной баней, удалите лишнюю воду с горки влажной салфеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы получить не менее 3 поперечных сечений через зрачок. Чем менее опытен исследователь, тем больше разделов должно быть получено, чтобы обеспечить секционирование на уровне ученика. Поместите пару секций на один слайд. Также для менее опытных исследователей разрежьте ткань потолще, например, на участки толщиной 4 мкм или 5 мкм. Использование микротома с прилегающей водяной баней значительно облегчает процесс переноса срезов тканей на предметные стекла, если сравнивать с использованием микротомов без водяных бань. Еще один момент, на который стоит обратить внимание, заключается в том, что объектив может быть трудно прорезать. Чтобы свести к минимуму риск повреждения тканей хрупким хрусталиком, используйте только острые лезвия микротомов, предназначенные для разрезания твердых тканей. Рассмотрите возможность использования одного лезвия для обрезки, а другого — для резки секций, чтобы свести к минимуму затупление лезвия.
   7. Поместите предметное стекло в лабораторный инкубатор, установленный на 56 °C, на 30 минут.
   8. Извлеките предметное стекло из инкубатора и начните окрашивать его гематоксилином и эозином (H&E) вручную, последовательно помещая и снимая предметное стекло с помощью следующих растворов. Начните с 7 мин ксилола, 5 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором) и 5 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором). Затем 2 мин 96% EtOH, 1 мин 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 1 мин 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором).
   9. Промыть в 5 мин проточной водой, затем 2 мин гематоксилином Майера, 2 мин гематоксилином Майера (еще один стакан с чистым раствором), 5 мин проточной водой, 5 мин проточной водой (другой, чистый стакан).
   10. Добавьте 1% Эозин в течение 2 мин, затем 1 мин 96% EtOH, 30 с 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 30 с 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 2 мин ксилола, 1 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором), 2 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором).
       ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте автоматическую морилку для слайдов.
   11. Запечатайте предметное стекло с помощью автоматического запечатывателя слайдов. Подготовленное предметное стекло готово к хранению и оценке под световым микроскопом.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно выполнить герметизацию слайдов вручную, поместив тонкий слой полистирольного монтажника на окрашенную ткань и накрыв его стеклянным покровным стеклом.
       ВНИМАНИЕ: Действия, включающие PFA, EtOH, ацетон и ксилол, следует выполнять под лабораторным вытяжным шкафом.

2. Подготовка секции глазных яблок крысы и монтаж предметного стекла

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол представляет собой метод подготовки срезов глазных яблок крыс и был разработан с использованием глазных яблок, собранных от: самцов крыс SHR в возрасте 6 недель (средний вес 115,5 г), самцов крыс SHR в возрасте 12 недель с артериальной гипертензией (средний вес 262,5 г), самцов крыс WKY в возрасте 6 недель (средний вес 143,5 г), самцов крыс WKY в возрасте 12 недель (средний вес 265 г), самцы крыс Льюиса в возрасте 12 недель (средний вес 310 г) и самцы крыс Льюиса в возрасте 16 недель с индуцированным сахарным диабетом (средний вес 259 г).

1. Энуклеация
   1. Используйте небольшие щипцы, чтобы открыть веки. Надавите на веки, чтобы выпасть глазное яблоко.
   2. Рассеките глазное яблоко от глазницы, отрезав ткань за глазным яблоком маленькими острыми ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отметьте глазные яблоки для лучшей ориентации, например, наложив небольшой шов на культю сухожилия латеральной прямой мышцы глазного яблока, чтобы отметить височную сторону глазного яблока.
2. Фиксация тканей
   1. Поместите энуклеированное глазное яблоко в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и дайте ему отдохнуть в 4% растворе параформальдегида (PFA), растворенном в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 24 ч.
   2. После этого обработайте глазное яблоко в течение 24 ч в 10% растворе сахарозы, затем снимите и поместите его на 24 ч в 20% раствор сахарозы, и, наконец, удалите и поместите его на 24 ч в 30% раствор сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего процесса держите глазное яблоко при низкой температуре 4 °C. Следует избегать проколов иглой для инфильтрации сахарозы, чтобы свести к минимуму риск повреждения глазного яблока.
3. Замораживание и хранение тканей
   1. Извлеките глазное яблоко из раствора сахарозы и высушите его, слегка промокнув бумажным полотенцем.
   2. Поместите глазное яблоко в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и заморозьте его при температуре -80 °C для дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении при температуре -80 °C глазное яблоко может оставаться жизнеспособным до 12 месяцев до будущей обработки.
4. Подготовка предметного стекла
   1. Извлеките глазное яблоко из морозильной камеры и из микроцентрифужной пробирки. Разрежьте глазное яблоко пополам по сагиттальной плоскости острым скальпелем. Снимите и выбросьте объектив.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап проще всего выполнять на замороженном глазном яблоке, только что добытом из морозилки. Во время разреза глазного яблока хрусталик может повредить окружающие ткани. Чтобы свести к минимуму риск повреждения, используйте очень острый скальпель и будьте осторожны.
   2. Разморозьте глазное яблоко при комнатной температуре. Переместите две половинки в кассету и промойте под проточной водой в течение 20 минут, чтобы смыть сахарозу.
   3. Обезвоживайте глазное яблоко, помещая его в вытяжной шкаф, а затем извлекая из него следующие растворы: 70% раствор этилового спирта (EtOH) в течение 15 минут, 80% раствор EtOH в течение 15 минут, 96% раствор EtOH в течение 15 минут, 99,9% раствор EtOH в течение 15 минут и ацетон в течение 7 минут.
   4. Очистите глазное яблоко, поместив его в ксилол на 7 минут под вытяжной шкаф.
   5. Растопите парафин, поместив немного твердого парафина в стакан и поместив его в лабораторный инкубатор, установленный на температуру выше температуры плавления, указанной производителем парафина (температура плавления парафина составляет от 46 °C до 68 °C). После того как парафин полностью растает (время зависит от количества используемого парафина), переместите глазное яблоко в стакан с парафином и держите в тепле в течение 1 ч. В течение 1 часа инфильтрации парафина в ткани перемешивайте парафин каждые 10 - 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа можно использовать тканевый процессор, который обеспечивает инфильтрацию парафина во время перемешивания раствора.
   6. Вставьте глазное яблоко в парафиновый блок, как описано ниже.
      1. Откройте кассету и снимите верхнюю крышку. Выберите металлическую форму и налейте небольшое количество парафина, чтобы покрыть дно формы. Извлеките глазное яблоко из кассеты с помощью щипцов и поместите его на парафин в форму. Поместите одну половинку глазного яблока дном чашки вверх, а другую – вниз.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение половинок глазного яблока одной половиной дном чашки вверх, а другой - вниз, позволит разрезать ткани в сагиттальной плоскости. Таким образом, будут получены срезы роговицы, радужной оболочки, цилиарного тела, зрачка, периферической и центральной сетчатки.
      2. Кратковременно охладите форму на охлаждающей пластине, установленной на -15 °C, чтобы парафин слегка застыл и закрепил глазное яблоко на месте. Тщательно накройте глазное яблоко парафином и дно кассеты до образования блока. Положите блок на охлаждающую пластину для полного застывания. Затем извлеките блок из металлической формы и поместите парафиновые блоки обратно на охлаждающую пластину не менее чем на 15 минут, чтобы они остыли перед резкой.
   7. Закрепите парафиновый блок в микротоме. Установите микротом, чтобы обрезать излишки парафина с блока (мы ставим его на срез 15 мкм) и обрезайте до тех пор, пока не дойдете до центра глазного яблока. Изменяем настройки микротома, чтобы вырезать более тонкие секции (мы устанавливаем его на 3,5 мкм) и помещаем секцию на слайд. Если вы используете микротом с прилегающей водяной баней, удалите лишнюю воду с горки влажной салфеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы получить не менее 3 поперечных сечений через зрачок. Чем менее опытен исследователь, тем больше разделов должно быть получено, чтобы обеспечить секционирование на уровне ученика. Поместите пару секций на один слайд. Также для менее опытных исследователей разрежьте ткань потолще, например, на участки толщиной 4 мкм или 5 мкм. Использование микротома с прилегающей водяной баней значительно облегчает процесс переноса срезов тканей на предметные стекла, если сравнивать с использованием микротомов без водяных бань.
   8. Снимите предметное стекло и начните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) вручную, последовательно помещая и удаляя предметное стекло к следующим растворам и обратно. Начните с 7 мин ксилола, 5 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором) и 5 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором). Затем 2 мин 96% EtOH, 1 мин 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 1 мин 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором).
   9. Промыть в 5 мин проточной водой, затем 2 мин гематоксилином Майера, 2 мин гематоксилином Майера (еще один стакан с чистым раствором), 5 мин проточной водой, 5 мин проточной водой (другой, чистый стакан).
   10. Добавьте 1% Эозин в течение 2 мин, затем 1 мин 96% EtOH, 30 с 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 30 с 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 2 мин ксилола, 1 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором), 2 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором).
       ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте автоматическую морилку для слайдов.
   11. Запечатайте предметное стекло с помощью автоматического запечатывателя слайдов. Подготовленные предметные стекла готовы к хранению и оценке под световым микроскопом.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы выполните герметизацию слайдов вручную, поместив тонкий слой полистирольного монтажника на окрашенную ткань и накрыв стеклянным покровным стеклом.
       ВНИМАНИЕ: Действия, включающие PFA, EtOH, ацетон и ксилол, следует выполнять под лабораторным вытяжным шкафом.

3. Оценка срезов глазного яблока

1. Сканирование слайдов
   1. Поместите предметное стекло в гистопатологический сканер предметного стекла и отсканируйте срезы в режиме сканирования: 40x. Сохраняйте изображения в виде цифровых файлов с высоким разрешением.
2. Анализ слайдов
   1. Откройте отсканированный файл с помощью программного обеспечения для просмотра изображений. Найдите поперечные сечения зрачков и проанализируйте три последовательных сечения.
   2. Найдите самую толстую часть сетчатки и увеличьте изображение до 20x, нажав на поле увеличения в верхнем правом углу и выбрав 20x. Переместите мышь на уровень ELM в самой толстой части сетчатки и нажмите правую кнопку мыши, выберите «Аннотация» и «Линейка».
   3. Переместите мышь в сторону ILM и нажмите левую кнопку. Озаглавьте значение измерения RT и установите флажки для отображения заголовка и отображения длины. Таким образом, толщина сетчатки (RT) будет измерена, и измерение будет показано в μm. Репрезентативные результаты показаны на рисунках 2 и 3.
   4. С помощью линейки измерьте толщину каждого слоя сетчатки, включая ONL, OPL, INL и IPL, и пометьте их. Репрезентативные результаты показаны на рисунках 4 и 5.
   5. Чтобы подсчитать количество клеток в GCL, установите заранее заданную длину сетчатки. Например, для сетчатки мыши используйте один срез 500 мкм, а для сетчатки крысы — пять срезов по 100 мкм.
   6. С помощью линейки измерьте выбранное расстояние вдоль GCL. Нажмите правую кнопку мыши и выберите Аннотация > Сохранено > 1x RBC. Нажмите на каждую клетку, идентифицированную как круглое, окрашенное гематоксилином тело вдоль GCL по заданной длине сетчатки. Посчитайте количество обведенных клеток. Репрезентативные результаты показаны на рисунках 6 и 7.
   7. Проанализировав три последовательных участка, нарисуйте среднее значение по всем измерениям.

Результаты

С помощью представленного протокола можно детально оценить анатомию и морфологию конкретных структур глазного яблока. Наша команда сосредоточена на исследовании патомеханизмов нейродегенерации при заболеваниях сетчатки, таких как глаукома, диабетическая ретиноп?...

Обсуждение

Гистологическое исследование глазного яблока мыши и крысы является мощным инструментом в области экспериментальной офтальмологии. Он может предоставить новую информацию, связанную с изменениями в глазных структурах в ходе офтальмологических заболеваний, которые ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Chempur	111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm Tips	World Precision Instruments	14095	small, microsurgical forceps
Eosin	Mar-Four	4P.05.2001/L	Aqueous solution
Ethyl alcohol 96 %	Chempur	CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %	Chempur	CH.ETYL.ALK.99,9%BW	Use to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483E	NuAire	13027D0034	Freezing temperature - 80 °C
Glass slides	Mar-Four	MI.15.01673	Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper	Leica Biosystems	14,04,78,80,101	Automated slide sealer
Mayer's hematoxylin	Chempur	124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mm	Leica Biosystems	3803081
Microme HM 340 E	Thermo Scientific	90-519-0	Microtome
Microtome razor blades	Mar-Four	HI.N.35	Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassette	Mar-Four	LN.13874550
Microwave Hybrid Tissue Processor	Milestone
Multistainer Leica ST5020	Leica Biosystems		Automated slide stainer
NanoZoomer 2.0-HT slide scanner	Hamamatsu	C9600	Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing software	Hamamatsu	U12388-01	Image viewing software
Paraffin Pathowax Plus	Mar-Four	4P.PWP.010	Melting temperature 56 °C - 58 °C
Paraformaldehyde	Sigma - Aldrich	441244-1KG	Prepare a 4% solution in PBS
PBS Tablets	Merck Millipore	524650-1EA	Use to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Thermo Scientific	69715
Refrigerator-freezer EN14000AW	Electrolux	925032562-00	refrigeration 4 °C
Scalpel blade	Swann-Morton	T.OST.SKAL00.024
Sucrose	Chempur	427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, Curved	World Precision Instruments	501925	curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealers	Mar-Four	KP-3020/SMRH001
Xylene	Chempur	CH.KSYL.5l.METAL.OP