Микроинъекция эмбриона для трансгенеза у дрозофилы

Резюме

В этой статье в качестве примера берется интегразо-опосредованный трансгенез phiC31 у дрозофил и представлен оптимизированный протокол микроинъекции эмбриона, что является важным шагом для создания трансгенных мух.

Аннотация

Трансгенез у дрозофил является важным подходом к изучению функции генов на уровне организма. Микроинъекция эмбриона является важным этапом для создания трансгенных мух. Для микроинъекции требуются некоторые виды оборудования, в том числе микроинъектор, микроманипулятор, инвертированный микроскоп и стереомикроскоп. Плазмиды, выделенные с помощью набора для мини-подготовки плазмид, подходят для микроинъекций. Эмбрионы на стадии пребластодермы или синцитиальной бластодермы, где ядра имеют общую цитоплазму, подвергаются микроинъекции. Клеточный фильтр облегчает процесс дехорионизации эмбрионов. Оптимальное время для дехорионации и высыхания эмбрионов необходимо определить экспериментальным путем. Чтобы повысить эффективность микроинъекции эмбриона, иглы, подготовленные пуллером, должны быть скошены игольчатой машиной. В процессе шлифовки игл мы используем ножной воздушный насос с манометром, чтобы избежать капиллярного эффекта кончика иглы. Мы обычно вводим 120-140 эмбрионов для каждой плазмиды и получаем по крайней мере одну трансгенную линию примерно для 85% плазмид. В данной статье в качестве примера берется интегразо-опосредованный трансгенез phiC31 у дрозофил и представлен подробный протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы.

Введение

Плодовая муха Drosophila melanogaster чрезвычайно поддается генетическим манипуляциям и генетическому анализу. Трансгенные плодовые мушки широко используются в биологических исследованиях. С момента своего появления в начале 1980-х годов транспозон-опосредованный P-элементами транспозон-опосредованный был незаменим^{для исследований} дрозофил. В некоторых сценариях другие транспозоны, такие как piggyBac и Minos, также использовались для трансгенеза у дрозофил ². Трансгены через транспозон случайным образом встраиваются в геном дрозофилы, и уровни экспрессии трансгенов в разных геномных ло....

протокол

1. Подготовка плазмид

1. Выделите плазмиды из 4 мл бактериальных культур в течение ночи с помощью набора для мини-подготовки плазмид. Элюируйте 40 мкл элюирующего буфера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение плазмид с помощью набора midi-prep для плазмид не требуется. Набор для мини-подготовки плазмид может полностью удовлетворить экспериментальные требования к микроинъекции эмбрионов. В этом протоколе подготовленные плазмиды UAS-кДНК/ORF содержат десять копий UAS, минимальный промотор Hsp70, сайт attB, ген мини-белого цвета и ген, представляющий интерес.
2. Определите концентрацию плазмидной ДНК с помощью спектрофотометра и храните при температуре ....

Результаты

Кончик инъекционной иглы скошен с помощью игольчатого станка (Рисунок 1). За час можно скосить 50-60 спиц. ДНК микроинъецируется в заднюю часть эмбриона на стадии пребластодермы или синцитиальной бластодермы, где ядра имеют общую цитоплазму (рис. 2A). Задняя ?.......

Обсуждение

Здесь мы представляем протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы. Для phiC31-опосредованного сайт-специфического трансгенеза мы вводили 120-140 эмбрионов в каждую плазмиду и получали, по крайней мере, одну трансгенную линию примерно для 85% плазмид (дополнительная ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745