Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье в качестве примера берется интегразо-опосредованный трансгенез phiC31 у дрозофил и представлен оптимизированный протокол микроинъекции эмбриона, что является важным шагом для создания трансгенных мух.

Аннотация

Трансгенез у дрозофил является важным подходом к изучению функции генов на уровне организма. Микроинъекция эмбриона является важным этапом для создания трансгенных мух. Для микроинъекции требуются некоторые виды оборудования, в том числе микроинъектор, микроманипулятор, инвертированный микроскоп и стереомикроскоп. Плазмиды, выделенные с помощью набора для мини-подготовки плазмид, подходят для микроинъекций. Эмбрионы на стадии пребластодермы или синцитиальной бластодермы, где ядра имеют общую цитоплазму, подвергаются микроинъекции. Клеточный фильтр облегчает процесс дехорионизации эмбрионов. Оптимальное время для дехорионации и высыхания эмбрионов необходимо определить экспериментальным путем. Чтобы повысить эффективность микроинъекции эмбриона, иглы, подготовленные пуллером, должны быть скошены игольчатой машиной. В процессе шлифовки игл мы используем ножной воздушный насос с манометром, чтобы избежать капиллярного эффекта кончика иглы. Мы обычно вводим 120-140 эмбрионов для каждой плазмиды и получаем по крайней мере одну трансгенную линию примерно для 85% плазмид. В данной статье в качестве примера берется интегразо-опосредованный трансгенез phiC31 у дрозофил и представлен подробный протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы.

Введение

Плодовая муха Drosophila melanogaster чрезвычайно поддается генетическим манипуляциям и генетическому анализу. Трансгенные плодовые мушки широко используются в биологических исследованиях. С момента своего появления в начале 1980-х годов транспозон-опосредованный P-элементами транспозон-опосредованный был незаменимдля исследований дрозофил. В некоторых сценариях другие транспозоны, такие как piggyBac и Minos, также использовались для трансгенеза у дрозофил 2. Трансгены через транспозон случайным образом встраиваются в геном дрозофилы, и уровни экспрессии трансгенов в разных геномных ло....

протокол

1. Подготовка плазмид

  1. Выделите плазмиды из 4 мл бактериальных культур в течение ночи с помощью набора для мини-подготовки плазмид. Элюируйте 40 мкл элюирующего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение плазмид с помощью набора midi-prep для плазмид не требуется. Набор для мини-подготовки плазмид может полностью удовлетворить экспериментальные требования к микроинъекции эмбрионов. В этом протоколе подготовленные плазмиды UAS-кДНК/ORF содержат десять копий UAS, минимальный промотор Hsp70, сайт attB, ген мини-белого цвета и ген, представляющий интерес.
  2. Определите концентрацию плазмидной ДНК с помощью спектрофотометра и храните при температуре ....

Результаты

Кончик инъекционной иглы скошен с помощью игольчатого станка (Рисунок 1). За час можно скосить 50-60 спиц. ДНК микроинъецируется в заднюю часть эмбриона на стадии пребластодермы или синцитиальной бластодермы, где ядра имеют общую цитоплазму (рис. 2A). Задняя ?.......

Обсуждение

Здесь мы представляем протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы. Для phiC31-опосредованного сайт-специфического трансгенеза мы вводили 120-140 эмбрионов в каждую плазмиду и получали, по крайней мере, одну трансгенную линию примерно для 85% плазмид (дополнительная ?.......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Фонда научных исследований талантов высокого уровня Университета Южного Китая.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 μm Cell StrainerNEST258367
3M double-sided adhesive3M415
Borosilicate glassSUTTERB100-75-10
Diamond abrasive plateSUTTER104E
FLAMING/BROWN Micropipette PullerSUTTERP-1000
Foot air pump with pressure gaugeShenfengSF8705D
Halocarbon oil 27SigmaH8773
Halocarbon oil 700SigmaH8898
Inverted microscopeNikonECLIPSE Ts2R
Microinjection pumpeppendorfFemtoJet 4i
MicromanipulatoreppendorfTransferMan 4r
Micropipette BevelerSUTTERBV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)CITOLAS10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)CITOLAS188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)LAIBOER4190152
Photo-Flo 200Kodak1026269
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Stereo MicroscopeNikonSMZ745

Ссылки

  1. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  2. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

PhiC31

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены