Доклиническая модель сепсис-индуцированной миопатии с неприменением у мышей

Резюме

Эта мышиная модель сочетает в себе септическое повреждение с отсутствием мышц задних конечностей, чтобы повторить прикованный к постели черту типичного пациента с сепсисом. Модель представляет собой значительный отход от предыдущих моделей для изучения мышечной дисфункции при сепсисе и является воспроизводимым подходом к рассмотрению терапевтических стратегий для лечения этого состояния.

Аннотация

Сепсис является основной причиной смерти в больницах. Улучшение лечения приводит к увеличению числа выживших после сепсиса. Примерно у 75% выживших развивается мышечная слабость и атрофия, что увеличивает частоту повторных госпитализаций и смертности. Тем не менее, имеющиеся доклинические модели сепсиса не учитывают неиспользование скелетных мышц, что является ключевым компонентом развития миопатии, вызванной сепсисом. Наша цель в этом протоколе — предоставить пошаговое руководство для модели мыши, которое воспроизводит клинические условия, в которых находится прикованный к постели пациент с сепсисом. Для разработки этой модели были использованы самцы мышей C57Bl/6. Мышам проводили лигирование слепой кишки и пункцию (CLP) для индуцирования сепсиса. Через четыре дня после CLP мышей подвергали подвешиванию задних конечностей (HLS) в течение семи дней. Результаты сравнивали с симуляционными операциями и/или животными с нормальной способностью передвижения (НА). Мышцы были препарированы для механики мышц in vitro и морфологической оценки. Модель приводит к выраженной мышечной атрофии и слабости, аналогичному фенотипу, наблюдаемому у пациентов с сепсисом. Модель представляет собой платформу для тестирования потенциальных терапевтических стратегий для смягчения миопатии, вызванной сепсисом.

Введение

Сепсис является опасным для жизни состоянием, вызванным гиперактивным иммунным ответом, который отрицательно влияет на множественные системы органов, что приводит к серьезной нагрузке на системы здравоохранения во всем мире¹. В последнее время госпитальная смертность, связанная с сепсисом, снизилась благодаря улучшению ведения в отделении интенсивной терапии (ОИТ) ^1,2. Тем не менее, примерно у 75% пациентов, переживших первичное септическое повреждение, развивается атрофия скелетных мышц (например, уменьшение площади поперечного сечения) и слабость (например, снижение способности вырабатывать силу)^3,4. Это явление было охарактеризовано как сепсис-индуцированная миопатия, тесно связанная с нарушением физической активности и отсутствием независимости при выполнении повседневных задач, что приводит к повторной госпитализации и смертности в течение пяти лет после первоначального эпизода⁵.

Из-за агрессивной и генерализованной инфекции пациенты с сепсисом подвергаются длительным периодам постельного режима во время выздоровления в отделении интенсивной терапии. В этом контексте скелетные мышцы подвергаются серьезным нарушениям, что, вероятно, усугубляет мышечную атрофию и слабость ^3,4. В настоящее время ни одно лечение не позволяет эффективно бороться с миопатией, вызванной сепсисом. В доступных доклинических моделях, разработанных для лечения миопатии, использовали лигирование и пункцию слепой кишки (CLP)⁶, суспензию слепой кишки⁷ или инъекцию очищенного липополисахарида (ЛПС), который является компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий⁸. Несмотря на то, что эти модели успешно доставляют инфекцию, они не воспроизводят должным образом неиспользование мышц, наблюдаемое у септических хозяев, за исключением естественного снижения физической активности, наблюдаемого^{у септических} животных.

Основной целью данного исследования является подробное описание того, как правильно выполнить модель сепсис-индуцированной миопатии с неиспользованием у мышей. Мы демонстрируем возможность комбинирования CLP в качестве модели сепсиса с подвешиванием задних конечностей (HLS) в качестве модели неиспользования для изучения миопатии, вызванной сепсисом, у мышей³. Кроме того, представлены репрезентативные результаты механики мышц и типичных морфологических изменений в ответ на модель.

протокол

Процедуры были рассмотрены и одобрены IACUC Университета Флориды (#202200000227). Для настоящего исследования были использованы самцы мышей C57BL/6J в возрасте 17 недель с массой тела от 27 г до 34 г. Экспериментальные процедуры и сроки, изложенные в этом протоколе, показаны на рисунке 1. Как уже указано, протокол охватывает в общей сложности 11 дней. Животные проходят операцию по выживанию (CLP/Sham) в день 0, после чего в течение четырех дней проводится инфузионная и обезболивающая поддержка. На 4-й день у животных начинается ЗОЖ продолжительностью 7 дней. Терминальные эксперименты проводятся на 11-й день. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Лигирование и пункция слепой кишки (CLP)

1. После получения животных из коммерческого источника, дайте им акклиматизироваться в помещении для животных не менее 1 недели перед проведением CLP (или фиктивных) операций. Это поможет свести к минимуму стресс, связанный с транспортировкой.
2. Разместите мышей в группах, придерживаясь местных рекомендаций IACUC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве общего указания, животные содержатся максимум по 5 мышей в клетке до дня операции. Стандартные клетки размером 7,25 дюйма в ширину, 11,75 дюйма в длину и 5 дюймов в высоту используются и обставляются подстилкой из кукурузных початков. Поддерживается цикл 12 часов : 12 часов света и темноты, свет включается в 7 утра и выключается в 7 вечера. Температура в помещении поддерживается на уровне 20-22 °C, а относительная влажность (RH) поддерживается в пределах от 30% до 60%. Неограниченный доступ к стандартному корму и воде гарантируется.
3. Для выполнения CLP необходимо обезболить животное изофлураном (2,5%, 500 мл/мин) в индукционной камере. Подтвердите анестезию, зажав лапу пинцетом. После глубокой анестезии, что подтверждается отсутствием рефлекторного отхода от защемления лапы, перевести животное на продолжение анестезии с помощью носового конуса (2,5%, 100-125 мл/мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Асептические методы должны применяться на протяжении всей процедуры.
4. Нанесите ветеринарную мазь-смазку для глаз, чтобы защитить глаза животного от потенциального повреждения или травмы, вызванной носовым конусом, во время операции.
5. Чтобы очистить место операции, используйте имеющееся в продаже средство для удаления волос. Снимайте мех только с нижней части живота, не допуская чрезмерного воздействия на кожу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать машинки для стрижки шерсти животных, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить кожу.
6. После того, как место операции будет обнажено, очистите область с помощью трех применений повидон-йода (или эквивалентного бактерицидного скраба), а затем прополощите его 70% спиртом между каждым применением.
7. Введите однократную дозу 3,25 мг/кг бупренорфина с пролонгированным высвобождением или его эквивалент в соответствии с обезболивающим лечением, одобренным вашим местным IACUC.
8. Перенесите мышь в операционную область. Изолируйте место операции с помощью клейкой простыни. Под глубоким наркозом сделайте вентральный разрез по средней линии (~2 см) на коже с помощью лезвия скальпеля.
   1. С помощью ножниц отделите кожу от мышечного слоя. Лезвием скальпеля сделайте меньший надрез (~1 см) в мышечном слое. После того, как кишечник визуализирован, с помощью тупых щипцов найдите слепую кишку и выведите ее наружу.
9. После наружной экстериоризации перевязать слепую кишку с помощью стерильного рассасывающегося полиглактина 5-0. Учитывайте площадь перевязанной слепой кишки, определяемую как расстояние от дистального конца слепой кишки до точки лигирования, так как она будет способствовать тяжести инфекции. Чтобы воспроизвести представленные здесь результаты, подвяжите слепую кишку на расстоянии 1 см от ее дистальной точки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лигирование большей площади слепой кишки приведет к увеличению тяжести¹⁰.
10. С помощью иглы 27 G проперте слепую кишку насквозь, позволяя фекальному содержимому вытечь. С осторожностью отожмите слепую кишку, чтобы вывести наружу каловые массы. Чтобы выполнить фиктивную операцию, выполните те же действия, обнажая слепую кишку животного. Однако не перевязывайте и не прокалывайте слепую кишку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Игольчатый манометр напрямую влияет на тяжесть инфекции. Чтобы вызвать инфекцию низкой степени, рекомендуется использовать иглы от 26 G до 28 G. Обратите внимание, что использование более толстых игольчатых датчиков приведет к увеличению смертности, и животные могут не переносить последующую фазу подвешивания задних конечностей в соответствии с протоколом.
11. Переместите слепую кишку в брюшную полость. Закройте мышечный слой стерильным рассасывающимся швом 5-0. Закройте кожу нейлоновым нерассасывающимся швом 5-0. После наложения кожного шва введите стерильный физиологический раствор (1 мл для самцов и 0,5 мл для самок) путем подкожной инъекции в спину животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для закрытия мышечного слоя рекомендуется техника наложения непрерывного шва, тогда как для слоя кожи рекомендуется техника прерывистого шва. Проконсультируйтесь и соблюдайте местные рекомендации IACUC по наложению швов в хирургии выживания.
12. После операции животных помещают в чистую клетку поверх матраса с подогревом или грелкой, установленной при температуре 35 °C. Наблюдайте за мышью каждые 15 минут в течение первого часа после восстановления после анестезии, после чего ее можно вернуть в помещение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте минимальное количество корма на полу клетки, чтобы животные могли есть в неограниченном количестве, не затрагивая операционное поле. После возвращения в учреждение животные проверяются два раза в день после оценки состояния животных с помощью септика (шаг 3).
13. Обеспечьте стерильный физиологический раствор и обезболивающую поддержку в течение следующих четырех дней, чтобы хирургический разрез зажил.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневный мониторинг температуры поверхности мечевидного мозга и массы тела помогает вести точные записи о тяжести сепсиса^.

2. Подвеска задних конечностей (HLS)

1. Для проведения ЗОЖ следователи должны следовать местным этическим рекомендациям IACUC. Это включает в себя обеспечение использования соответствующих размеров клетки и напольного покрытия, которые являются критически важными аспектами для адаптации животных к передвижению, привычкам в еде и питье в условиях ЗОЖ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для заживления ран рекомендуется 4 дня восстановления после CLP.
2. Через 4 дня после восстановления после CLP или фиктивной операции обезболить животное под действием легкого потока изофлурана (2,5%, 100-125 мл/мин). Прикрепите хвостик мыши к короткой металлической цепочке с помощью поролоновой ленты. Поместите металлическую цепь параллельно хвосту, при этом поролоновая лента плотно обхватывает хвост и цепь вместе.
3. Чтобы обеспечить подвешивание задних конечностей, прикрепите металлическую цепь к крюку, соединенному с перекладиной по центру клетки. Кроме того, прикрепите вторую небольшую перекладину, которая может перемещаться вдоль перекладины, чтобы обеспечить большую способность животного к передвижению.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животные должны иметь возможность передвигаться с помощью передних конечностей с помощью металлической решетки на полу клетки.
4. Отрегулируйте высоту подвешенных конечностей, чтобы предотвратить контакт лап с гранулами корма. Следите за животными и очищайте выбритый участок вокруг зашитой кожи вручную ватным тампоном, смоченным в воде, не менее двух раз в день в течение периода суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чистка имеет решающее значение для предотвращения инфекции в месте операции, особенно из-за ожога мочи из-за приподнятого положения тела.
5. Чтобы воспроизвести результаты, убедитесь, что животные проходят 7-дневное подвешивание задних конечностей. Продолжительность была определена на основе предыдущих исследований временного курса, показывающих минимальное время, необходимое для подвешивания задних конечностей для оказания значимого воздействия на скелетные мышцы в несептических условиях^12,13.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выживаемость животного, дискомфорт или дистресс будут увеличиваться в зависимости от тяжести инфекции.

3. Оценка животных с помощью септика

ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка клинического состояния животного является ключевым аспектом отслеживания тяжести после CLP/фиктивных операций. Кроме того, в соответствии с требованиями IACUC, должны быть установлены гуманные конечные точки для благополучия животных. Для решения этих проблем и обеспечения стандартов ежедневного ухода за животными были использованы указания по проведению оценки животных с использованием модифицированной оценки мышиного сепсиса (MMSS)¹⁴.

1. Используйте MMSS (Дополнительный файл 1) для оценки животного. Обратите внимание, что для каждой категории оценка 0 представляет здоровое животное. Оценивайте животное два раза в день от 0 до 3 в зависимости от тяжести инфекции.
2. Для повышения точности измеряйте температуру поверхности мечевидного мозга и массу тела два раза в день^11,15 и записывайте вместе с оценочным листом MMSS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные колебания температуры поверхности мечевидного мечевидного мозга и массы тела представлены на дополнительном рисунке 1.
3. Обратитесь в местный IACUC для получения гуманных конечных точек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для воспроизведения результатов в качестве конечных точек использовались следующие критерии: (1) Потеря массы тела >40% от исходного уровня. (2) Температура <30 °C или снижение на >5 °C от предыдущего значения. (3) Оценка 3 балла по следующим параметрам: Реакция на стимул, уровень сознания или качество дыхания. (4) Общая суточная MSSS ≥17. Описанная здесь оценка предназначена для проведения после операции и у животных, находящихся в нормальном состоянии передвижения. Рекомендуется воздержаться от контакта с животными, подвергающимися ЗОЖ, чтобы предотвратить контакт между их задними конечностями и поверхностями. После окончательной оценки усыпьте животное в соответствии с рекомендациями местного комитета по этике животных.

Результаты

Для получения репрезентативных данных, представленных в результатах, были использованы самцы мышей C57BL/6J в возрасте 17 недель с массой тела от 27 до 34 г. Весь протокол занимает одиннадцать дней и состоит из хирургического вмешательства (CLP или симуляции), поддержки физра?...

Обсуждение

В действующем протоколе содержатся технические рекомендации по внедрению новой доклинической модели сепсис-индуцированной миопатии. Все материалы и важные этапы подробно описаны для воспроизведения модели. Этот подход может воспроизвести дисфункцию скелетных мыш...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Ethicon Coated Vicryl	Ethicon	D5792	Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"	Ethicon	662G	Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G	BD	305136 for 27g needle	Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #000664
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	Swabs for topical application of iodine.
Cryostat	(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415	Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)	Fisher Scientific		To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages	Custom Made	N/A	These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube	Optixcare		Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11	Fine Science		Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac	Zimmer	736579	Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific Corporation	SS-01	Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus	Aurora Scientific	Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C