Экстракция ДНК и сравнение старых и свежих образцов некрофильных мух

Резюме

В этой статье описывается протокол экстракции свежей и старой некрофильной ДНК мухи с использованием модифицированного общего набора для экстракции ДНК.

Аннотация

В общей сложности пять образцов Chrysomya megacephala - три свежих образца, один образец, хранившийся в спирте в течение 2 лет, и один образец, хранившийся в сухом запечатанном хранилище в течение 2 лет, защищенных только от света - были отобраны для изучения того, может ли набор для экстракции ДНК крови извлечь ДНК у некрофильных мух и определить, может ли алкоголь продлить сохранение ДНК некрофильных мух. Во-первых, набор для извлечения ДНК из грудной клетки был использован для извлечения ДНК из тканей грудной клетки. Затем чистота и концентрация ДНК были исследованы с помощью считывателя микропланшетов и флуориметра. Наконец, ПЦР-амплификацию и электрофорез экстрагированной ДНК проводили с помощью некрофильных мухоспецифичных праймеров, расположенных в митохондриальной последовательности гена CO I. Результаты показали, что чистота ДНК всех образцов была выше 2,0. Концентрация ДНК наблюдалась в следующем порядке: свежие образцы > законсервированные спиртом старые образцы > необработанные, старые образцы. Все образцы имели специфические электрофоретические полосы после амплификации ПЦР. В заключение, набор для экстракции ДНК крови может быть использован для успешного извлечения ДНК из некрофильных мух, а концентрация ДНК в свежих образцах мух выше, чем в старых образцах мух. Мухи могут долго храниться в спирте.

Введение

Вывод о времени смерти всегда был одним из ключевых и сложных вопросов, требующих решения в судебной практике. В практике криминалистики для уголовного дела определение интервала вскрытия играет решающую роль в определении времени совершения преступления, установлении подозреваемого и сужении рамок расследования. Традиционные методы определения времени смерти основаны в первую очередь на ранних посмертных явлениях, которые, как правило, могут быть использованы только для определения времени смерти в течение 24 часов. Однако длительное время смерти не может быть определено посмертными явлениями. В настоящее время в судебно-медицинском сообществе общепризнано, что судеб....

протокол

Примечание: В общей сложности в этом протоколе было использовано пять образцов C. megacephala - три свежих образца (Fresh 1, Fresh 2 и Fresh 3), один образец хранился в спирте в течение 2 лет (Old 1) и один образец хранился в сухом герметичном хранилище в течение 2 лет, защищенном только от света (Old 2). Образцы должны быть промаркированы в соответствии с требованиями эксперимента.

1. Общее хранение и подготовка образцов

1. Отбор и подготовка образцов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно работайте в вытяжном шкафу при нанесении этилацетата для уничтожения мух-некрофагов. Перед взвешиванием удалите жидкость с поверхно....

Результаты

Мы использовали считыватель микропланшетов для измерения значений OD260 и OD280 экстрагированного раствора ДНК, а затем получили значения OD260/OD280 для оценки чистоты ДНК. OD260/OD280 всех свежих образцов и старого образца 1 был больше 2. OD260/OD280 старого образца 2 имел максимальное значение 2,187, хотя с?.......

Обсуждение

Экстракция ДНК является наиболее важным звеном в молекулярной идентификации некрофильных мух, а метод ее экстракции и качество извлеченной ДНК напрямую влияют на последующее обнаружение. В этом эксперименте мы успешно извлекли ДНК из некрофильных мух с помощью обычного набора крови, .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer AE	Qiagen	172026832	DNA elution buffer
Buffer AL	Qiagen	172028374	lysis buffer
Buffer ATL	Qiagen	172028162	tissue lysis buffer
Buffer AW1	Qiagen	172028760	protein removal buffer
Buffer AW2	Qiagen	57203108	desalination buffer
C1-J-2495	Taihe Biotechnology	TW21109216	forword primer
C1-N-2800	Taihe Biotechnology	TW21109217	reverse primer
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
DNeasy Mini spin column	Qiagen	166050343	DNA adsorption column
Dry Bath Incubator	Miulab	DKT200-2D	used for heating
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	Qiagen	172026218	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Qubit 3.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	2321611188
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Standard#1	Thermo Fisher Scientific	2342797
Standard#2	Thermo Fisher Scientific	2342797
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Working Solution	Thermo Fisher Scientific	2342797