Экстракция ДНК и сравнение старых и свежих образцов некрофильных мух

Резюме

В этой статье описывается протокол экстракции свежей и старой некрофильной ДНК мухи с использованием модифицированного общего набора для экстракции ДНК.

Аннотация

В общей сложности пять образцов Chrysomya megacephala - три свежих образца, один образец, хранившийся в спирте в течение 2 лет, и один образец, хранившийся в сухом запечатанном хранилище в течение 2 лет, защищенных только от света - были отобраны для изучения того, может ли набор для экстракции ДНК крови извлечь ДНК у некрофильных мух и определить, может ли алкоголь продлить сохранение ДНК некрофильных мух. Во-первых, набор для извлечения ДНК из грудной клетки был использован для извлечения ДНК из тканей грудной клетки. Затем чистота и концентрация ДНК были исследованы с помощью считывателя микропланшетов и флуориметра. Наконец, ПЦР-амплификацию и электрофорез экстрагированной ДНК проводили с помощью некрофильных мухоспецифичных праймеров, расположенных в митохондриальной последовательности гена CO I. Результаты показали, что чистота ДНК всех образцов была выше 2,0. Концентрация ДНК наблюдалась в следующем порядке: свежие образцы > законсервированные спиртом старые образцы > необработанные, старые образцы. Все образцы имели специфические электрофоретические полосы после амплификации ПЦР. В заключение, набор для экстракции ДНК крови может быть использован для успешного извлечения ДНК из некрофильных мух, а концентрация ДНК в свежих образцах мух выше, чем в старых образцах мух. Мухи могут долго храниться в спирте.

Введение

Вывод о времени смерти всегда был одним из ключевых и сложных вопросов, требующих решения в судебной практике. В практике криминалистики для уголовного дела определение интервала вскрытия играет решающую роль в определении времени совершения преступления, установлении подозреваемого и сужении рамок расследования. Традиционные методы определения времени смерти основаны в первую очередь на ранних посмертных явлениях, которые, как правило, могут быть использованы только для определения времени смерти в течение 24 часов. Однако длительное время смерти не может быть определено посмертными явлениями. В настоящее время в судебно-медицинском сообществе общепризнано, что судебная энтомология может стать эффективным методом определения более длительного времени смерти.

Насекомые-некрофаги названы так из-за их личинок, которые питаются трупами. Среди них, когда присутствует труп, взрослые некрофильные мухи будут первыми, кто доберется до трупа и отложит свои яйца или личинки. Личинки питаются трупной тканью и превращаются в куколок, которые оперяются во взрослых особей. Некрофильные мухи играют огромную роль в практике криминалистики из-за их регулярного жизненного цикла и географического распространения, например, вычитая время смерти и определяя место смерти ^1,2. Однако барьером для использования некрофильных мух в криминалистической практике является видовая идентификация. Морфологические методы до сих пор используются в качестве авторитетного метода для видовой идентификации некрофильных мух. Однако морфологическая идентификация видов требует высокой степени целостности насекомых. Если мухи находились на разных стадиях развития или из-за морфологических изменений, вызванных выбором окружающей среды, все это затрудняет морфологическое исследование. В частности, морфология куколок и панцирей куколок, которые чаще всего обнаруживаются на месте преступления, едва узнаваема. Это, наряду с нехваткой специалистов по морфологии, создает огромные трудности для морфологической идентификации видов. Таким образом, появилось применение методов молекулярной биологии для видовой идентификации мух, что снижает сложность морфологической идентификации и не зависит от стадии развития 3,4,5,6,7.

Первым шагом в идентификации видов некрофильных мух на основе методов молекулярной биологии является эффективная экстракция ДНК, в то время как специализированные наборы для экстракции ДНК насекомых в настоящее время обычно не доступны. А как использовать обычные наборы крови для извлечения ДНК некрофильных мух, становится все более актуальным с криминалистической точки зрения. Некрофильные мухи, найденные на местах преступлений, часто изуродованы или подверглись разложению и деградации ДНК. Образцы мух не доступны для извлечения ДНК сразу после получения, или, если это возможно, целые образцы должны быть сохранены из-за требований к сохранности доказательств. Исходя из вышеуказанных требований, в данном исследовании мы применили набор ДНК крови на основе расщепления протеиназы К и отобрали три свежих образца Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) (рис. 1), один старый образец C. megacephala, помещенный в алкоголь на два года, и один образец C. megacephala , помещенный в защищенное от света хранилище на два года, взвесили каждый из пяти образцов. выбирал ткань грудной клетки насекомого для экстракции ДНК. Сравнивая качество и чистоту ДНК, выделенной из старого и нового образцов, проводили ПЦР-амплификацию и электрофорез экстрагированной ДНК с некрофильными мухоспецифичными праймерами, расположенными в митохондриальной последовательности гена CO .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: В общей сложности в этом протоколе было использовано пять образцов C. megacephala - три свежих образца (Fresh 1, Fresh 2 и Fresh 3), один образец хранился в спирте в течение 2 лет (Old 1) и один образец хранился в сухом герметичном хранилище в течение 2 лет, защищенном только от света (Old 2). Образцы должны быть промаркированы в соответствии с требованиями эксперимента.

1. Общее хранение и подготовка образцов

1. Отбор и подготовка образцов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно работайте в вытяжном шкафу при нанесении этилацетата для уничтожения мух-некрофагов. Перед взвешиванием удалите жидкость с поверхности мухи.
   1. Свежие образцы: Поместите три собранных образца мух в газовые флаконы после их уничтожения этилацетатом. Взвесьте и назовите образцы как Fresh 1, Fresh 2 и Fresh 3 и немедленно используйте их в экспериментах.
      Примечание: Образцы свежей мухи в этом протоколе имели массу 56,8 мг, 49,3 мг и 52,1 мг.
   2. Старый образец 1: Извлеките образцы от мух, убитые этилацетатом и хранящиеся в наполненных спиртом центрифужных пробирках в течение 2 лет в герметичной защите, защищенной от света при комнатной температуре. Взвесьте образец после адсорбции поверхностной жидкости фильтровальной бумагой; Назовем его Старый 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масса Old 1 составила 42,3 мг в этом протоколе.
   3. Старый образец 2: Извлеките убитый этилацетатом образец мухи и храните в центрифужной пробирке в течение 2 лет в герметичной защите, защищенной от света при комнатной температуре. Взвесьте и назовите его Старый 2.
2. Подготовка перед экстракцией
   1. Добавьте небольшое количество жидкого азота для охлаждения емкости из нержавеющей стали; Дождитесь, пока весь жидкий азот испарится.
   2. Положите в контейнер образец от мухи; Медленно вливайте жидкий азот, чтобы жидкий азот не разбрызгивался и не попадал на образец насекомого.
   3. Заморозьте образцы в жидком азоте. Удаляйте образцы после того, как жидкий азот испарится.
   4. Отделите грудную клетку по отдельности, поместите в центрифужную пробирку объемом 2 мл и нарежьте на мельчайшие срезы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте образец на мелкие кусочки, чтобы его можно было полностью расщепить, и ДНК могла быть высвобождена в больших количествах.
   5. Повторите описанные выше шаги для каждой мухи, заморозьте по отдельности, а затем переместите в новую центрифужную пробирку, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение ДНК.

2. Экстракция ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугирования должны выполняться при комнатной температуре (15-25 °C) в микроцентрифуге. Все действия должны выполняться в строгом соответствии с принципами асептики и во избежание перекрестного загрязнения.

1. Лизис тканей
   1. Добавьте 180 мкл буфера для лизиса тканей в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую клипсированный образец.
   2. Добавьте 20 мкл протеиназы K. Тщательно перемешайте при вортексе при 3 000 об/мин в течение 10 с и инкубируйте при 56 °C до полного лизирования тканей насекомого.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавлять больше протеиназы К следует в том случае, если ткань не полностью переварена. Лизис обычно завершается за 1-3 часа, а также может продлить время лизиса на ночь.
2. Осаждение ДНК
   1. Вихрь при 3 000 об/мин в течение 15 с. Добавьте в образец 200 мкл буфера для лизиса и тщательно перемешайте путем вортексирования при 3 000 об/мин в течение 15 с.
   2. Добавьте 200 μл этанола (96-100%) и снова тщательно перемешайте, перемешивая при 3 000 об/мин в течение 15 секунд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса и этанол могут быть предварительно добавлены вместе за один шаг для экономии времени. Белый осадок может образоваться при добавлении лизисного буфера и этанола.
3. Пипетируйте смесь в адсорбционную колонку ДНК, помещенную в пробирку для сбора объемом 2 мл. Центрифугируйте при 6 000 × г в течение 1 мин. Выбросьте проточную и сборную трубку.
4. Поместите адсорбционную колонку ДНК из предыдущего этапа в новую пробирку для сбора объемом 2 мл, добавьте 500 мкл буфера для удаления белка и центрифугируйте при 6000 × г в течение 1 минуты. Выбросьте проточную и сборную трубку.
5. Перенесите адсорбционную колонку ДНК в новую пробирку для сбора объемом 2 мл, добавьте 500 мкл опреснительного буфера и центрифугируйте при температуре 20 000 × г в течение 3 минут, чтобы высушить мембрану адсорбционной колонки ДНК. Выбросьте проточную и сборную трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта стадия центрифугирования обеспечивает удаление остатков этанола перед последующим элюированием. Если есть остатки этанола, снова центрифугируйте при 20 000 × г в течение 1 минуты.
6. Поместите адсорбционную колонку ДНК в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, непосредственно нанесите 100 мкл буфера для элюирования ДНК на мембрану колонки, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 минуты, а затем центрифугируйте при 6000 × г в течение 1 минуты для элюирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Элюирование 100 мкл (вместо 200 мкл) увеличивает конечную концентрацию ДНК в элюате, но также снижает общий выход ДНК. Чтобы максимизировать выход ДНК, повторите элюирование один раз, как описано в шаге 2.8.
7. Храните образцы ДНК при температуре 4 °C (до 1 недели) или -80 °C для длительного хранения.

3. Определение концентрации ДНК

1. Определите значения OD 260 и OD 280 для сравнения чистоты ДНК и концентрации нуклеиновых кислот с помощью считывателя микропланшетов. Повторите три раза на каждом образце.
2. Определите концентрацию извлеченной ДНК с помощью флуориметра с помощью сопутствующего набора, с тремя репликами для каждого образца.
   1. В две центрифужные пробирки объемом 0,5 мл взять по 190 мкл рабочего раствора, взять по 10 мкл Стандарта #1 и Стандарта #2, добавить их в рабочие растворы и хранить в незащищенном от света месте не менее 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарт #1 и Стандарт #2 точно откалиброваны для определенной концентрации ДНК. Стандартные решения должны быть точно сконфигурированы, чтобы обеспечить формирование точной стандартной кривой. Стандарт #1 представляет собой образец двухцепочечной ДНК (дцДНК) с плотностью 0,2 нг/мкл; стандарт #2 составляет 2 000 нг/μл. Рабочим раствором является краситель, который специфически связывается с дцДНК.
   2. Возьмите 2 μL исследуемой ДНК и смешайте его со 198 μL рабочего раствора в центрифужной пробирке объемом 0,5 мл и держите в незащищенном от света месте не менее 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация ДНК низкая, добавьте 5 μL исследуемой ДНК со 195 μL рабочего раствора.
   3. Через 15 минут включите прибор и выберите «Измерение концентрации дцДНК» | Большой запас хода. Сначала протестируйте Стандарт #1, а затем Стандарт #2 для получения стандартной кривой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартное решение должно быть использовано в тот же день после его настройки; Если оставить его слишком долго, это приведет к большой ошибке в стандартной кривой.
   4. Поместите исследуемые образцы в пробирные лунки один за другим, отрегулируйте объем спайка ДНК до 2 μл, повторите измерение три раза, возьмите среднее значение и запишите.

4. ПЦР и электрофоретическое обнаружение

ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность митохондриального гена CO длиной 278.о. была взята для амплификации методом ПЦР с помощью прямого праймера C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG и обратного праймера C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC⁸, а затем был проведен электрофорез в 2% агарозном геле для проверки эффекта амплификации и верифицирована длина продуктов амплификации.

1. Настройте 20 мкл системы амплификации ПЦР, добавив 10 мкл 2x смеси Taq, 1 мкл каждого праймера, 5 мкл ddH₂O и 3 мкл матричной ДНК; Хорошо перемешайте в течение 10 с в центрифуге.
2. Используйте следующие параметры цикла ПЦР: предденатурация 95 °C в течение 10 мин; денатурация 95 °С в течение 30 с, отжиг 48 °С в течение 30 с, растяжение 72 °С в течение 45 с, всего 40 циклов; и окончательное продление до 72 °C в течение 10 мин.
3. Подвергайте продукты после ПЦР электрофорезу с 2% агарозным гелем, а после электрофореза помещайте их на систему визуализации геля для фотоанализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы использовали считыватель микропланшетов для измерения значений OD260 и OD280 экстрагированного раствора ДНК, а затем получили значения OD260/OD280 для оценки чистоты ДНК. OD260/OD280 всех свежих образцов и старого образца 1 был больше 2. OD260/OD280 старого образца 2 имел максимальное значение 2,187, хотя с?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Экстракция ДНК является наиболее важным звеном в молекулярной идентификации некрофильных мух, а метод ее экстракции и качество извлеченной ДНК напрямую влияют на последующее обнаружение. В этом эксперименте мы успешно извлекли ДНК из некрофильных мух с помощью обычного набора крови, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer AE	Qiagen	172026832	DNA elution buffer
Buffer AL	Qiagen	172028374	lysis buffer
Buffer ATL	Qiagen	172028162	tissue lysis buffer
Buffer AW1	Qiagen	172028760	protein removal buffer
Buffer AW2	Qiagen	57203108	desalination buffer
C1-J-2495	Taihe Biotechnology	TW21109216	forword primer
C1-N-2800	Taihe Biotechnology	TW21109217	reverse primer
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
DNeasy Mini spin column	Qiagen	166050343	DNA adsorption column
Dry Bath Incubator	Miulab	DKT200-2D	used for heating
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	Qiagen	172026218	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Qubit 3.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	2321611188
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Standard#1	Thermo Fisher Scientific	2342797
Standard#2	Thermo Fisher Scientific	2342797
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Working Solution	Thermo Fisher Scientific	2342797