Использование органоидов кишечника человека для понимания эпителия тонкой кишки на уровне транскрипции отдельных клеток

Резюме

Протокол сочетает в себе технологию органоидов кишечника человека с транскриптомным анализом отдельных клеток, чтобы обеспечить значительное понимание ранее неизученной биологии кишечника.

Аннотация

Транскриптомика одиночных клеток произвела революцию в нашем понимании клеточной биологии человеческого организма. Современные культуры органоидов тонкого кишечника человека обеспечивают модельные системы ex vivo , которые устраняют разрыв между животными моделями и клиническими исследованиями. Применение транскриптомики одиночных клеток к моделям кишечных органоидов (ГИО) человека раскрывает ранее непризнанную клеточную биологию, биохимию и физиологию желудочно-кишечного тракта. Передовые платформы транскриптомики одиночных клеток используют микрофлюидное разделение и штрихкодирование для создания библиотек кДНК. Эти кДНК со штрих-кодами могут быть легко секвенированы платформами секвенирования нового поколения и использованы различными инструментами визуализации для создания карт. В данной работе мы описываем методы культивирования и дифференциации ГИО тонкого кишечника человека в различных форматах и процедуры выделения жизнеспособных клеток из этих форматов, которые подходят для использования в платформах профилирования транскрипции одиночных клеток. Эти протоколы и процедуры облегчают использование ГИО тонкого кишечника для получения более глубокого понимания клеточного ответа эпителия кишечника человека на транскрипционном уровне в контексте различных сред.

Введение

Эпителий тонкой кишки имеет две четко выраженные зоны: крипту, в которой находятся кишечные стволовые клетки (ISC), и ворсинки, которые состоят из дифференцированных клеток секреторной и абсорбционной линий. К этой сложности добавляется региональная специфичность эпителия, которая обеспечивает уникальные функциональные свойства между областями тонкой кишки. Новаторская работа позволила создать условия культивирования, в которых как крипта тонкой кишки человека, так и зоны ворсин могут быть созданы ex vivo из хирургических тканей или биопсии тканей¹. Эти культуры преодолевают разрыв между исследованиями на животных и клиническими испыта....

протокол

Используемые здесь линии органоидов были получены из Центра заболеваний пищеварительной системы Техасского медицинского центра GEMS Core. Вкратце, чтобы первоначально установить органоидные линии, образцы донорских тканей промывали и ферментативно переваривали для высвобождения кишечных крипт. Крипты были встроены в базальную мембрану и культивировались в среде. Институциональный наблюдательный совет Медицинского колледжа Бейлора одобрил протокол исследования для получения образцов тканей, из которых были созданы органоидные линии, и было получено информированное согласие от всех доноров на создание органоидных линий из донорской ткани.

Результаты

Суспензии одиночных клеток объединяли из 2-3 лунок мембранных клеточных культур, монослоя и 3D HIO для обеспечения достаточного выхода клеток и снижения вариаций от скважины к лунке. Библиотеки одиночных клеток были подготовлены с использованием реагентов, специфичных для платформы проф.......

Обсуждение

Используя платформы геномики отдельных клеток, сложные биологические системы, такие как тканевые культуры HIO, моделирующие кишечный эпителий, могут быть расщеплены для получения индивидуального клеточного вклада в общий биологический ответ ^4,5,6

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM