Эффективный подход к трансгенезу для доставки генов в эмбриональное сердце мыши

Резюме

В этом протоколе представлена подробная методологическая основа для основанного на электропорации трансгенеза сердечных клеток в развивающихся сердцах мышей. Представленные здесь видеоматериалы облегчат изучение этой универсальной техники.

Аннотация

Сердце млекопитающих — сложный орган, формирующийся в процессе развития с помощью очень разнообразных популяций клеток-предшественников. Происхождение, сроки пополнения и судьба этих прародителей имеют жизненно важное значение для правильного развития этого органа. Молекулярные механизмы, которые управляют морфогенезом сердца, имеют важное значение для понимания патогенеза врожденных пороков сердца и эмбриональной регенерации сердца. Классические подходы к исследованию этих механизмов использовали создание трансгенных мышей для оценки функции конкретных генов во время развития сердца. Тем не менее, трансгенез у мышей является сложным, трудоемким процессом, который часто не может быть выполнен для оценки роли конкретных генов в развитии сердца. Чтобы решить эту проблему, мы разработали протокол эффективной электропорации и культивирования эмбриональных сердец мышей, что позволяет с помощью транзиторного трансгенеза быстро оценить влияние усиления или потери функции генов, участвующих в развитии сердца. Используя эту методологию, мы успешно сверхэкспрессировали Meis1 в эмбриональном сердце, отдавая предпочтение трансфекции эпикардиальных клеток, демонстрируя возможности метода.

Введение

Сердце – это первый орган, который формируется во время эмбрионального развития. Этот процесс включает в себя пространственно-временную координацию различных популяций клеток-предшественников из различных областей эмбриона. Все это происходит в то время, когда развивающееся сердце продолжает биться и функционировать, подчеркивая замечательную координацию, необходимую для его формирования ^1,2,3. Учитывая решающую роль сердца, строгая регуляция на клеточном и молекулярном уровнях имеет важное значение для его правильного формирования ^4,5

протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных CNIC и соответствуют действующему законодательству, включая Директиву ЕС 2010/63EU и Рекомендацию 2007/526/EC, как это предусмотрено испанским законодательством в соответствии с Real Decreto 53/2013. Для этого протокола использовались самки мышей дикого типа CD-1 в возрасте 15-21 недели. Подробная информация об используемых животных, реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Плазмида и подготовка инструмента

1. Сначала приготовьте смесь для электропорации, добавив желаемую плазмидную ДНК в лед в кон....

Результаты

Чтобы продемонстрировать эффективность этого метода при проведении экспериментов по усилению функции (GOF) для соответствующих регуляторов развития сердца, была проведена электропорация с гиперэкспрессией транскрипционного фактора Meis1. Для этого из эмбрионов E9.5 была выделена РНК, а д?.......

Обсуждение

В целом, описанная здесь методология предлагает надежную основу для экспрессии трансгенных конструкций в развивающемся эпикарде (рисунок 4B), как показано на примере сверхэкспрессии Meis1 (рисунок 4C). При наличии соответствующих конструкций этот протокол ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumont	11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	BD Falcon	353043
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm Cell Strainer	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL tubes	BD Falcon	352070
70 µm Cell Strainer	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antibody	Invitrogen	A10262	1:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody	Invitrogen	14-6503-82	1:500 dilution used
CD1 Wild Type mice			Provided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signalling Technologies	9661	1:400 dilution used
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 dilution used
Dispase/collagenase	Roche	10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG expression plasmid	Addgene	#89689
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri dishes 35 × 10 mm	BD Falcon	351008
Petri dishes 60 × 15 mm	BD Falcon	353002
Phenol Red	Merck	P3532
Pipette tips			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody	Abcam	ab89901	1:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SC	Nepa Gene	CUY664-10X15
Sterile PBS			Provided and autoclaved by technical unit
Sucrose	Millipore	84100
Tweezer electrodes with variable gap	Nepa Gene	CUY650P5