Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В этом протоколе представлена подробная методологическая основа для основанного на электропорации трансгенеза сердечных клеток в развивающихся сердцах мышей. Представленные здесь видеоматериалы облегчат изучение этой универсальной техники.
Сердце млекопитающих — сложный орган, формирующийся в процессе развития с помощью очень разнообразных популяций клеток-предшественников. Происхождение, сроки пополнения и судьба этих прародителей имеют жизненно важное значение для правильного развития этого органа. Молекулярные механизмы, которые управляют морфогенезом сердца, имеют важное значение для понимания патогенеза врожденных пороков сердца и эмбриональной регенерации сердца. Классические подходы к исследованию этих механизмов использовали создание трансгенных мышей для оценки функции конкретных генов во время развития сердца. Тем не менее, трансгенез у мышей является сложным, трудоемким процессом, который часто не может быть выполнен для оценки роли конкретных генов в развитии сердца. Чтобы решить эту проблему, мы разработали протокол эффективной электропорации и культивирования эмбриональных сердец мышей, что позволяет с помощью транзиторного трансгенеза быстро оценить влияние усиления или потери функции генов, участвующих в развитии сердца. Используя эту методологию, мы успешно сверхэкспрессировали Meis1 в эмбриональном сердце, отдавая предпочтение трансфекции эпикардиальных клеток, демонстрируя возможности метода.
Сердце – это первый орган, который формируется во время эмбрионального развития. Этот процесс включает в себя пространственно-временную координацию различных популяций клеток-предшественников из различных областей эмбриона. Все это происходит в то время, когда развивающееся сердце продолжает биться и функционировать, подчеркивая замечательную координацию, необходимую для его формирования 1,2,3. Учитывая решающую роль сердца, строгая регуляция на клеточном и молекулярном уровнях имеет важное значение для его правильного формирования 4,5
Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных CNIC и соответствуют действующему законодательству, включая Директиву ЕС 2010/63EU и Рекомендацию 2007/526/EC, как это предусмотрено испанским законодательством в соответствии с Real Decreto 53/2013. Для этого протокола использовались самки мышей дикого типа CD-1 в возрасте 15-21 недели. Подробная информация об используемых животных, реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.
1. Плазмида и подготовка инструмента
Чтобы продемонстрировать эффективность этого метода при проведении экспериментов по усилению функции (GOF) для соответствующих регуляторов развития сердца, была проведена электропорация с гиперэкспрессией транскрипционного фактора Meis1. Для этого из эмбрионов E9.5 была выделена РНК, а д?.......
В целом, описанная здесь методология предлагает надежную основу для экспрессии трансгенных конструкций в развивающемся эпикарде (рисунок 4B), как показано на примере сверхэкспрессии Meis1 (рисунок 4C). При наличии соответствующих конструкций этот протокол ?.......
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Это исследование было поддержано грантом RTI2018-097617-J-I00 от испанского Ministerio de Ciencia e Innovación и Acción 9 от Universidad de Jaén до O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 от испанского Ministerio de Ciencia e Innovación и грантом H2020-MSCA-ITN-2016-722427 от программы EU Horizon 2020 для M.T. JMG был поддержан стипендией PhD от Министерства науки Испании и Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Как CNIC, так и CBMSO поддерживаются Министерством науки Испании, а CNIC поддерживается Фондом ProCNIC.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
#55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 dilution used |
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 dilution used |
CD1 Wild Type mice | Provided by Animalary Unit (CNIC) | ||
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 dilution used |
DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 dilution used |
Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
Distilled water | |||
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
Liberase | Roche | 5401119001 | |
Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
pCAG expression plasmid | Addgene | #89689 | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Petri dishes 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
Petri dishes 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
Phenol Red | Merck | P3532 | |
Pipette tips | Reused from old laboratory equipment | ||
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 dilution used |
Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
Sterile PBS | Provided and autoclaved by technical unit | ||
Sucrose | Millipore | 84100 | |
Tweezer electrodes with variable gap | Nepa Gene | CUY650P5 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены