Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе представлена подробная методологическая основа для основанного на электропорации трансгенеза сердечных клеток в развивающихся сердцах мышей. Представленные здесь видеоматериалы облегчат изучение этой универсальной техники.

Аннотация

Сердце млекопитающих — сложный орган, формирующийся в процессе развития с помощью очень разнообразных популяций клеток-предшественников. Происхождение, сроки пополнения и судьба этих прародителей имеют жизненно важное значение для правильного развития этого органа. Молекулярные механизмы, которые управляют морфогенезом сердца, имеют важное значение для понимания патогенеза врожденных пороков сердца и эмбриональной регенерации сердца. Классические подходы к исследованию этих механизмов использовали создание трансгенных мышей для оценки функции конкретных генов во время развития сердца. Тем не менее, трансгенез у мышей является сложным, трудоемким процессом, который часто не может быть выполнен для оценки роли конкретных генов в развитии сердца. Чтобы решить эту проблему, мы разработали протокол эффективной электропорации и культивирования эмбриональных сердец мышей, что позволяет с помощью транзиторного трансгенеза быстро оценить влияние усиления или потери функции генов, участвующих в развитии сердца. Используя эту методологию, мы успешно сверхэкспрессировали Meis1 в эмбриональном сердце, отдавая предпочтение трансфекции эпикардиальных клеток, демонстрируя возможности метода.

Введение

Сердце – это первый орган, который формируется во время эмбрионального развития. Этот процесс включает в себя пространственно-временную координацию различных популяций клеток-предшественников из различных областей эмбриона. Все это происходит в то время, когда развивающееся сердце продолжает биться и функционировать, подчеркивая замечательную координацию, необходимую для его формирования 1,2,3. Учитывая решающую роль сердца, строгая регуляция на клеточном и молекулярном уровнях имеет важное значение для его правильного формирования 4,5

протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных CNIC и соответствуют действующему законодательству, включая Директиву ЕС 2010/63EU и Рекомендацию 2007/526/EC, как это предусмотрено испанским законодательством в соответствии с Real Decreto 53/2013. Для этого протокола использовались самки мышей дикого типа CD-1 в возрасте 15-21 недели. Подробная информация об используемых животных, реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Плазмида и подготовка инструмента

  1. Сначала приготовьте смесь для электропорации, добавив желаемую плазмидную ДНК в лед в кон....

Результаты

Чтобы продемонстрировать эффективность этого метода при проведении экспериментов по усилению функции (GOF) для соответствующих регуляторов развития сердца, была проведена электропорация с гиперэкспрессией транскрипционного фактора Meis1. Для этого из эмбрионов E9.5 была выделена РНК, а д?.......

Обсуждение

В целом, описанная здесь методология предлагает надежную основу для экспрессии трансгенных конструкций в развивающемся эпикарде (рисунок 4B), как показано на примере сверхэкспрессии Meis1 (рисунок 4C). При наличии соответствующих конструкций этот протокол ?.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом RTI2018-097617-J-I00 от испанского Ministerio de Ciencia e Innovación и Acción 9 от Universidad de Jaén до O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 от испанского Ministerio de Ciencia e Innovación и грантом H2020-MSCA-ITN-2016-722427 от программы EU Horizon 2020 для M.T. JMG был поддержан стипендией PhD от Министерства науки Испании и Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Как CNIC, так и CBMSO поддерживаются Министерством науки Испании, а CNIC поддерживается Фондом ProCNIC.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
#55 ForcepsDumont 11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture PlateBD Falcon353043
35 mm vise table GrandadoSKU 8798771617573
40 µm Cell StrainerFischer Scientific08-771-1
50 mL tubesBD Falcon352070
70 µm Cell StrainerCorningCLS431751
Anti-GFP Policlonal AntibodyInvitrogenA102621:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal AntibodyInvitrogen14-6503-821:500 dilution used
CD1 Wild Type miceProvided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) AntibodyCell Signalling Technologies96611:400 dilution used
DAPICell Signalling Technologies40831:1000 dilution used
Dispase/collagenaseRoche10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco10313021
Fetal Bovine SerumInvitrogen10438-026
Heracell 150i CO2 IncubatorThermo Scientific51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0Leica11524102
LiberaseRoche5401119001
Micropipette Puller Model P-97Sutter InstrumentSU-P-97
pCAG expression plasmidAddgene#89689
Penicillin-streptomycinInvitrogen15070-063
Petri dishes 35 × 10 mmBD Falcon351008
Petri dishes 60 × 15 mmBD Falcon353002
Phenol RedMerckP3532
Pipette tipsReused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SDJanvier Labs9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) AntibodyAbcamab899011:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SCNepa GeneCUY664-10X15
Sterile PBSProvided and autoclaved by technical unit
Sucrose Millipore84100
Tweezer electrodes with variable gapNepa GeneCUY650P5

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Meis1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены