Построение ортотопической ксенотрансплантатной модели немелкоклеточного рака легкого, имитирующей прогрессирование заболевания и предсказывающей активность лекарственных препаратов

Резюме

В данном исследовании представлена модель ортотопического немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), основанная на внутрилегочной инокуляции многоклеточных сфероидов флуоресцентных клеток A549-iRFP. Модель повторяет клинические стадии НМРЛ и реагирует на цисплатин в соответствии с динамическим мониторингом длинноволновой флуоресценции in vivo.

Аннотация

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) является высоколетальным заболеванием со сложным и неоднородным опухолевым микроокружением. В настоящее время распространенные животные модели, основанные на подкожном посеве суспензий раковых клеток, не повторяют микроокружение опухоли при НМРЛ. В данной работе мы описываем мышиную модель ксенотрансплантата ортотопического рака легкого, в которой используется внутрилегочная инокуляция трехмерных многоклеточных сфероидов (MCS). В частности, флуоресцентные клетки НМРЛ человека (A549-iRFP) культивировали в 96-луночных микропланшетах с низким уровнем прикрепления с коллагеном в течение 3 недель для формирования MCS, которые затем были инокулированы межреберно в левое легкое атимических голых мышей для создания модели ортотопического рака легких.

По сравнению с оригинальной клеточной линией A549, MCS клеточной линии A549-iRFP сходно реагировали на противоопухолевые препараты. Длинноволновый флуоресцентный сигнал клеток A549-iRFP сильно коррелировал с общими маркерами роста раковых клеток, включая объем сфероида, жизнеспособность клеток и уровень клеточных белков, что позволяет осуществлять динамический мониторинг роста рака in vivo с помощью флуоресцентной визуализации. После инокуляции мышам ксенотрансплантат A549-iRFP MCS достоверно прогрессировал через фазы, близко напоминающие клинические стадии НМРЛ, включая расширение первичной опухоли, возникновение соседних вторичных опухолей и метастазы раковых клеток в контралатеральное правое легкое и отдаленные органы. Кроме того, модель реагировала на эталонный препарат против рака легких, цисплатин, с ожидаемой токсичностью и более медленным прогрессированием рака. Таким образом, эта мышиная ортотопическая модель ксенотрансплантата НМРЛ послужит платформой для повторения прогрессирования заболевания и будет способствовать разработке потенциальных противоопухолевых препаратов.

Введение

Среди всех онкологических заболеваний рак легких не только наносит наибольшую смертность, но и занимает второе место по количеству новых пациентов каждый год^{в США.} Это разрушительное злокачественное новообразование является основным препятствием в современном здравоохранении, призывая к более глубокому пониманию его сложной биологии и более эффективным терапевтическим методам². Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет 85% случаев рака легких и имеет тенденцию развиваться в солидные опухоли³. Одной из основных проблем при раке легких является динамическое и гетерогенное микроокружение опухоли....

протокол

Исследование на животных было проведено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Тихоокеанском университете (Протоколы для животных 19R10 и 22R10). Для настоящего исследования были использованы восемь самцов атимических голых мышей в возрасте 5-6 недель весом 20-25 г, выведенных с использованием указанной диеты грызунов и содержащихся в условиях, свободных от патогенов (SPF). Клетки, подстилка и питьевая вода были автоклавными и регулярно менялись. Схема инокуляции опухоли у мышей показана на рисунке 1. Подробные сведения обо всех материалах и инструментах, используемых в этом протоколе,....

Результаты

Определение характеристик A549-iRFP MCS
A549-iRFP MCS были успешно культивированы в сфероидных микропланшетах с помощью коллагена и центрифугирования. Когда MCS достигал диаметра примерно 500 мкм через 1 неделю, A549 и A549-iRFP MCS подвергали воздействию различных противоопухолевых препаратов ?.......

Обсуждение

Создание A549-iRFP MCS является простой и легко воспроизводимой лабораторной процедурой и может быть переведено на формирование MCS для нескольких клеточных линий. MCS, полученный с помощью центрифугирования и коллагена, демонстрирует более цельную и солидную опухолевидную структуру в течен?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µL Glass Syringe	Hamilton	Part/REF #80601
20 G Needle	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet	Research Diets, Inc.	D10012M
Athymic Nude Mouse	Charles River Laboratories, Inc.	Strain Code: 490; homozygous
BCA	Pierce	23227
Buprenorphine Hydrochloride	Patterson Veterinary	NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683
Collagen	Gibco	A1064401
DMEM	Corning	MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	Open source tool (https://imagej.net/ij/)	N/A
Image Studio	LI-COR	Version 5.2
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine	Patterson Veterinary	NDC Number: 50989-0161-06
Microscope	Keyence	Model number: BZ-X710
Matrigel	Corning	CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System	LI-COR	Model number: 9140
PBS	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system	LI-COR	Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin	Corning	MT30002CI
Puromycin	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB	Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)	N/A
Surgical Clips--AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Xylazine	Patterson Veterinary	NDC Number: 61133-6017-01