Конвейер для многомасштабного трехмерного анатомического исследования сердца человека

Резюме

Этот протокол представляет собой комплексный конвейер для анализа образцов, полученных из человеческого сердца, которые охватывают микроскопический и макроскопический масштабы.

Аннотация

Детальное изучение здоровых человеческих сердец, отторгнутых для трансплантации, дает уникальную возможность провести структурный анализ в микроскопическом и макроскопическом масштабах. Эти методы включают очистку тканей (трехмерная (3D) визуализация органов, очищенных растворителем, с помощью модифицированного иммуномечения) и иммуногистохимическое окрашивание. Процедуры мезоскопического исследования включают стереоскопическую диссекцию и микрокомпьютерное томографическое сканирование (КТ). Процедуры макроскопического исследования включают в себя грубое вскрытие, фотографирование (включая анаглифы и фотограмметрию), компьютерную томографию и 3D-печать физически или виртуально расчлененного или всего сердца. Перед макроскопическим исследованием может быть выполнена давяще-перфузионная фиксация для поддержания 3D-архитектуры и физиологически значимой морфологии сердца. Применение этих методов в сочетании для изучения человеческого сердца является уникальным и имеет решающее значение для понимания взаимосвязи между различными анатомическими особенностями, такими как коронарная сосудистая сеть и иннервация миокарда, в контексте трехмерной архитектуры сердца. В этом протоколе подробно описываются методологии и приводятся репрезентативные результаты, иллюстрирующие прогресс в исследованиях анатомии сердца человека.

Введение

Поскольку функция следует за формой, понимание архитектуры сердца имеет основополагающее значение для понимания его физиологии. Несмотря на то, что многочисленные исследования выявили анатомию сердца от микро- до макромасштабов ^1,2,3, многие вопросы остаются нерешенными, особенно те, которые связаны с анатомией сердца человека. Отчасти это связано с тем, что в основных исследованиях, посвященных функциональной анатомии, обычно использовались сердца животных ^4,5,6, которые часто отличаются от человеческих сердец ^1,7,8. Кроме того, каждое отдельное исследование, даже с использованием образцов человеческого сердца, как правило, сосредоточено на очень специфических структурах, что затрудняет применение полученных результатов в контексте всего сердца. Это еще более верно, если сфокусированные структуры находятся в микро- или мезомасштабах, таких как перинексус⁹ и ганглионарные сплетения¹⁰.

В этом контексте системное структурное исследование человеческого сердца, отторгнутого для трансплантации, дает уникальную и редкую возможность получить исчерпывающий атлас сердечных структур в фокусе в микроскопическом и макроскопическом^{масштабах.} Протоколы микроскопического исследования включают очистку тканей (трехмерная (3D) визуализация органов, очищенных растворителем, с модифицированным иммуномечением, iDISCO+^)12,13 и иммуногистохимическое окрашивание. Протоколы мезоскопического обследования включают стереоскопическую диссекцию, макрофотографию и микрокомпьютерную томографию (КТ). Протоколы макроскопического исследования включают в себя полное вскрытие¹⁴, фотографирование (включая анаглифы и фотограмметрию)15,16,17, компьютерную томографию, виртуальное вскрытие ¹⁸ и 3D-печать физически или виртуально рассеченного или всего^{сердца17}. При подготовке к макроскопическому исследованию проводится давло-перфузионная фиксация для поддержания 3D-архитектуры и физиологически значимой морфологии сердца 14,19,20,21. Совместное применение этих методов уникально и имеет решающее значение для корреляции различных анатомических особенностей в контексте 3D-архитектуры человеческого сердца.

Поскольку возможность получения образца сердца человека без патологии крайне ограничена, описанный здесь многомасштабный подход позволяет максимально использовать образец. Применяя различные процедуры, описанные ниже, репрезентативные результаты продемонстрируют читателю, как полученные результаты могут быть использованы для различных целей, включая открытия в научных исследованиях¹¹ (всесторонний анализ иннервации сердца, распределения ганглионированных сплетений), совершенствование клинических процедур (моделирование хирургических и интервенционных подходов) и анатомическое образование (реальная 3D-демонстрация анатомии сердца).

протокол

В этом исследовании использовались обезличенные образцы тканей, собранные из донорских человеческих сердец, и оно было одобрено Институциональным наблюдательным советом Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA). Образцы были получены из не отказывающих сердец, которые были отторгнуты для трансплантации. Сердца были перфузированы под давлением, зафиксированы в 4% параформальдегиде (PFA) и визуализированы перед обработкой тканей в соответствии со следующими методами. На рисунке 1 обобщена блок-схема порядка проведения исследования. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Микромасштабное обследование

1. Очищение тканей с использованием протокола 3D-визуализации очищенных растворителем органов (iDISCO+) с помощью модифицированного иммуномечения.
   1. Рассеките 4% фиксированную PFA ткань с помощью скальпеля так, чтобы она помещалась в камеру размером от 3 мм × 16 мм × 25 мм для конфокальной микроскопии. Для визуализации более толстых тканей на предметном стекле могут быть установлены дополнительные камеры и/или спейсеры.
   2. Образцы обезвоживают с использованием градуированного метанола (MeOH) (20%, 40%, 60%, 80% и 100% MeOH в деионизированном H₂O [об./об.]) в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) с перемешиванием.
   3. Простирать со 100% MeOH в течение 1 часа при RT и погрузить в 66% дихлорметан/33% MeOH при RT с перемешиванием на ночь.
   4. На следующий день дважды постирайте в MeOH (100%) в течение 1 часа при RT, охладите при 4 °C и обработайте 5% H₂O₂ в MeOH (vol/vol) в течение ночи при 4 °C.
   5. Регидратируйте с помощью градуированной серии MeOH (80%, 60%, 40% и 20% MeOH) и простирайте в 0,01 моль/л PBS в течение 1 ч каждый при RT с перемешиванием.
   6. Промойте салфетки дважды в 0,01 моль/л PBS с 0,2% Triton X-100 в течение 1 ч на RT.
   7. Подготовьте к иммуномечению путем пермеабилизации в 0,01 моль/л PBS, 20% диметилсульфоксида (ДМСО), 0,2% Triton X-100 и 0,3 моль/л глицина в течение 2 дней при 37 °C с перемешиванием.
   8. Заблокируйте 0,01 моль/л PBS 10% ДМСО, 0,2% Triton X-100 и 5% нормальной ослиной сыворотки еще на 2 дня при 37 °C с перемешиванием.
   9. Мечите первичным антителом, совместимым с MeOH, конъюгированным с флуорофорами, разведенными в 0,01 моль/л PBS с 10 мг/мл гепарина (PTwH), 0,2% Tween-20, 5% ДМСО и 3% нормальной ослиной сыворотки в течение 3-4 дней при 37 °C с перемешиванием.
   10. Пополните раствор антител и инкубируйте еще 3-4 дня при 37 °С с перемешиванием.
   11. После 1-недельной инкубации в первичном растворе антител промыть 4–5 раз в PTwH на ночь в режиме ЛТ.
   12. Инкубировать с вторичными антителами, конъюгированными с флуорофорами, разведенными в ПТвГ, 3% нормальной сывороткой крови осляка в течение 3 суток при 37 °С с перемешиванием.
   13. Восполните раствор вторичного антитела, инкубируйте еще 3 дня при 37 °С с перемешиванием.
   14. После 6-дневной инкубации в растворе вторичных антител промыть в PTwH 4-5 раз на ночь в режиме РТ.
   15. Обезвоживайте с помощью градуированной серии MeOH (20%, 40%, 60%, 80%, 100% и 100% MeOH). Образец может храниться в течение ночи в режиме RT.
   16. Инкубировать в 66% дихлорметане/33% MeOH в течение 3 ч при РТ с перемешиванием.
   17. Дважды промыть в 100% дихлорметане в течение 15 мин при RT с перемешиванием.
   18. Инкубируйте и храните образцы в бензиловом эфире. Заполните пробирку, чтобы свести к минимуму окисление образца воздухом.
2. Визуализация образца, очищенного от тканей
   1. Прикрепите камеру, содержащую клей, к предметному стеклу и нанесите лак для ногтей по периметру камеры. Для более толстых тканей на предметном стекле могут быть установлены дополнительные камеры и/или спейсеры.
   2. Поместите очищенную салфетку в камеру, заполните бензиловым эфиром и наложите покровную накладку.
   3. Нанесите лак для ногтей вокруг покровного стекла, чтобы создать уплотнение.
   4. Получение изображений Tilescan и Z-стека с помощью вертикального лазерного сканирующего конфокального микроскопа с 5-кратным или 10-кратным объективом для получения изображений на глубине до рабочего расстояния от объектива.
   5. Изображение с разрешением 1024 x 1024 с использованием лазерных линий, соответствующих спектрам излучения используемых флуорофоров. Мышечная аутофлуоресценция видна с помощью лазерной линии с длиной волны 488 нм.
   6. Убедитесь, что размер шага по оси Z соизмерим с выборкой Найквиста на основе числовой апертуры указанного объектива¹¹.
   7. Сшивайте изображения и используйте программное обеспечение для 3D-визуализации.
   8. Создание фигур с использованием изображений проекции максимальной интенсивности (MIP) стеков Z для отдельных и объединенных каналов (рис. 2).
3. Иммуногистохимия
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как ткань погружена в парафин²², для создания предметных стекол для иммуногистохимического исследования используется следующая процедура.
   1. Приготовление согласующего раствора для показателя преломления (RIMS).
      1. Приготовьте 0,1 моль/л фосфатного буфера, добавив 10,9 г Na₂HPO₄ (безводный) и 3,1 г₂PO₄ (моногидрат) к деионизированному H₂O до общего объема 1 л (pH 7,4). Отфильтруйте и простерилизуйте раствор и храните его при RT.
      2. Разбавьте фосфатный буфер до 0,02 моль/л.
      3. Растворите Histodenz в 30 мл фосфатного буфера 0,02 моль/л, перемешивая раствор в течение 10 минут с помощью магнитной мешалки в конечной бутылке для хранения, которая может быть закрыта для минимизации испарения и загрязнения.
      4. Добавьте азид натрия до общей концентрации 0,01% (по массе) и отрегулируйте pH до 7,5 с помощью NaOH.
      5. Отрегулируйте RI, изменяя конечную концентрацию Histodenz.
      6. Храните RIMS в RT в течение нескольких месяцев. Выбросьте средства, если отмечается микробное загрязнение.
         ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ автоклавируйте растворы, содержащие азид натрия.
   2. Подготовка предметных стекол для иммуногистохимического исследования
      1. Создание участков толщиной 5 мкм с помощью микротома. Нанесите срез ткани на заряженные предметные стекла.
      2. Удалите парафин, инкубируя предметные стекла в >75% ксилола в течение 10 минут. Переместите предметные стекла во вторую емкость с ксилолом еще на 10 минут.
      3. Удалите ксилол, погрузив предметные стекла в 100% EtOH на 10 минут, затем в 95% EtOH на 5 минут и 70% EtOH на 5 минут.
      4. Промойте предметные стекла деионизированным H₂O в течение 5 минут.
      5. Предметные стекла погрузить в буфер для извлечения антигена на 25 мин при температуре 90-95^°С.
      6. Дайте контейнеру остыть до состояния RT в течение 1 ч с перемешиванием.
      7. Погрузите предметные стекла в буфер для замачивания (0,01 моль/л PBS + 0,4% Triton X-100) на 30 минут при температуре 4^°C.
      8. Обвяжите ткань пап-ручкой. Добавьте PBS к каждому предметному стеклу и поместите его во увлажненную камеру, чтобы предотвратить высыхание.
      9. Вымыть предметные стекла PBS в режиме RT с перемешиванием в течение 5 минут.
      10. Блок с блокирующим буфером (0,01 моль/л PBS + 10% сыворотка осляка + 0,1% TX-100) в течение 1 ч с перемешиванием.
      11. Инкубировать с первичным антителом, разведенным в блокирующем буфере, в течение ночи при 4^°C.
      12. На следующий день дайте предметным стеклам нагреться до температуры RT в течение 15 минут.
      13. Промойте предметные стекла 3 раза 0,01 моль/л PBS + 0,2% TritonX-100 в течение 5 минут.
      14. Инкубировать со вторичным антителом, разведенным в блокирующем буфере, в течение 1 ч при ЛТ с перемешиванием.
      15. Промойте предметные стекла 3 раза 0,01 моль/л PBS + 0,2% TritonX-100 в течение 5 минут.
      16. Промойте предметные стекла 3 раза с концентрацией 0,01 моль/л PBS в течение 5 минут.
      17. Нанесите 1 каплю RIMS с помощью пипетки и наклейте покровную пленку.
      18. Нанесите лак для ногтей вокруг покровного стекла, чтобы создать уплотнение.
      19. В качестве отрицательного контроля запустите образец без первичного антитела, чтобы продемонстрировать отсутствие специфического окрашивания.
   3. Визуализация иммуноокрашенных стекол
      1. Визуализируйте предметные стекла с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа с объективом 10x, 20x и 40x.
      2. Изображение с разрешением 1024 x 1024 с использованием лазерных линий, соответствующих спектрам излучения используемых вторичных антител.
      3. Создание фигур с использованием изображений проекции максимальной интенсивности (MIP) стеков Z для отдельных и объединенных каналов (рис. 3).

2. Мезомасштабная экспертиза

1. Стереоскопическая диссекция
   1. Выполняйте деликатные диссекции, фокусируясь на крошечных или тонких структурах, таких как атриовентрикулярный узел, артерия атриовентрикулярного узла и сердечное нервное сплетение (в масштабе от субмиллиметра до миллиметра) с помощью увеличительной настольной лампы с зажимом, хирургических телескопов или стереомикроскопа.
2. Микрокомпьютерная томография
   ПРИМЕЧАНИЕ: КТ проводится после пресс-перфузии и фиксации и на любых этапах диссекции с помощью микропозитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)/компьютерного томографа (Рисунок 4).
   1. Прогрейте источник рентгеновского излучения КТ в течение 25 минут перед визуализацией образца.
   2. Поместите образец сердца на кровать сканера.
   3. Переместите ложе сканера в горизонтальное положение 544 мм и вертикальное положение 14 мм, чтобы центрировать сердце в поле зрения КТ (FOV).
   4. Получение КТ-изображения с частотой 80 кВпик, 150 мкА с 720 проекциями в течение 1 минуты сканирования с пространственным разрешением 200 мкм.
   5. Восстановите данные компьютерной томографии с полем зрения 12 см x 12 см x 10 см и матрицей из 600 x 600 x 500 вокселей и сохраните их в виде файла DICOM.

3. Макромасштабная экспертиза

1. Перфузия и фиксация давлением
   Примечание: Авторы модифицируют ранее описанные методы перфузии и фиксации давлением и применяют их к здоровым человеческим сердцам, отторгнутым для трансплантации 14,19,20,21.
   1. Используйте высокопоточные насосы для фиксации перфузии. Используйте в качестве фиксатора 100% этанол¹⁴, 4% PFA или 10% формалин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце восстанавливают с помощью восходящей аорты, легочного ствола и обеих полых вен, а также легочных вен, резецированных как можно дистальнее и доставляемых в растворе^{Университета Висконсина 23}.
   2. Используйте две хирургические канюли 20-24 Fr для перфузии правых и левых отделов сердца. Для перфузии правых отделов сердца канюлируйте верхнюю полую вену и установите вентиляционное отверстие в легочном стволе или легочной артерии с помощью наполовину разрезанных пластиковых шприцев объемом 12-30 мл с наконечниками Luer-Lock, прикрепленными к трехсторонним запорным кранам.
   3. Окклюзируйте нижнюю полую вену и другую легочную артерию шпагатом, поставив пластиковый шприц соответствующего размера или центрифужную пробирку объемом 1,5-5,0 мл.
      1. Для антеградной перфузии левого отдела сердца канюлируйте одну из легочных вен и установите вентиляционное отверстие на дистальном разрезанном конце аорты с помощью наполовину разрезанных пластиковых шприцев объемом 12-30 мл с наконечниками Luer-Lock, прикрепленных к трехсторонним запорным кранам.
      2. Для ретроградной перфузии левого отдела сердца канюлейте одну из ветвей дуги аорты и установите отверстие на другой ветви дуги аорты. Поместите кончики канюль в оба желудочка.
   4. Другие отверстия сосудов закупорьте шпагатом после введения соответствующего размера закрытого наполовину разреза пластикового шприца или микроцентрифужной пробирки объемом 1,5-5,0 мл. Используйте тонкую марлю, чтобы закрыть вводимую часть шприцев/трубок/канюль, чтобы предотвратить утечку и соскальзывание. Устраните большие утечки с помощью швов, бандажей или комков. Допускаются небольшие утечки.
   5. Подвесьте сердце в пластиковом контейнере.
   6. Подсоедините 22-24 Fr мягкую пластиковую трубку к каждой канюле и вставьте другой конец трубки в емкость, наполненную фиксатором.
   7. Циркулируйте фиксатор через правый и левый контуры отделов сердца с помощью высокопоточного насоса, установленного со скоростью примерно 100-300 мл/мин для правых отделов сердца и 200-400 мл/мин для левых отделов сердца, чтобы достичь приблизительно 20 мм рт.ст. в правом желудочке и 80 мм рт.ст. в левом желудочке соответственно.
   8. Поддерживайте перфузию при температуре 4 °C в течение 24 ч.
   9. Промыть сердце 0,01 моль/л PBS в течение 30 мин с четырехкратным перемешиванием.
   10. Хранить сердце в 0,01 моль/л PBS/0,02% азида натрия при температуре 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионная фиксация давлением эффективна только для свежего сердца, а не для сердца, восстановленного из забальзамированного трупа.
2. Грубое рассечение
   1. Выполняйте прогрессивную диссекцию с фотографическими записями на каждом этапе диссекции.
   2. Чтобы сохранить клиническую значимость, обратите особое внимание на то, чтобы не допустить деформации каких-либо структур для поддержания физиологической морфологии сердца.
   3. Визуализируйте целевые структуры с использованием клинически значимой ориентации, такой как правая передняя косая ориентация.
3. Фотография
   1. Поместите неподвижное сердце с давлением на штатив с платформой, установленной с несколькими зубцами и возможностью вращения на 360^°.
   2. Сфотографируйте сердце с помощью цифровой однообъективной зеркальной камеры (Рисунок 5)^24, используя несколько светодиодных панелей, установленных на С-образных стойках, и широкую черную ткань с пуховым фоном.
   3. Фотографируйте с помощью объектива с большим фокусным расстоянием (200 мм) на рабочем расстоянии 4-6 футов для минимизации искажений объекта съемки¹⁴.
4. Анаглифы
   1. Чтобы отобразить анаглифические изображения, восстановите пару фотографий или объемных изображений из наборов данных компьютерной томографии с разницей угла поворота в горизонтальной плоскости в 10°.
   2. Преобразуйте набор этих двумерных (2D) изображений, называемых стереограммами, в анаглифы с помощью бесплатной программы¹⁶.
   3. Для просмотра анаглифа используйте красные/голубые очки.
5. Фотограмметрия
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фотограмметрия – это прикладная наука о создании трехмерной реконструкции поверхности на основе нескольких двумерных фотографий, сделанных под разными^{углами.}
   1. Подвесьте образец на C-Stand или поместите его на вращающийся стол, чтобы получить сотни разнонаправленных фотографий с помощью смартфона.
   2. Сгенерируйте 3D-модель в формате FBX с помощью имеющегося в продаже программного обеспечения.
6. Компьютерная томография
   ПРИМЕЧАНИЕ: КТ может быть выполнена после перфузии и фиксации давлением и на любой стадии диссекции.
   1. Подвесьте образец сердца к стержню, расположенному в верхней части контейнера. Чтобы сердце не раскачивалось во время сканирования, поддерживайте основание сердца пластиковыми зубцами, закрепленными на дне контейнера. Таким образом, воздух будет служить отрицательным контрастом.
   2. Выполнить компьютерную томографию можно с помощью серийно выпускаемого мультидетекторного рядного компьютерного томографа со следующими параметрами: напряжение трубки 120 кВ, ток трубки 800-900 мА, вращение гентри 280 мс. Произведение длины дозы обычно составляет 500-1200 mGy.cm.
   3. Реконструировать данные осевого изображения по следующим параметрам: толщина сечения, 0,6 мм; инкрементальный интервал, 0,3 мм; поле зрения, максимально маленькое (как правило, 100-200 мм); и матрица, 512 × 512.
7. Виртуальное вскрытие
   1. Анализируйте изображения компьютерной томографии с помощью коммерчески доступного программного обеспечения для создания изображений виртуального вскрытия.
      Примечание: Виртуальное препарирование представляет собой модификацию процесса объемной визуализации, при которой фокус смещается на стенки сердечных камер и сосудов¹⁸. В этом процессе ручное определение пороговых значений практически удаляет улучшенную камеру из исходных наборов данных.
   2. Визуализируйте необработанные стенки, перегородки и клапаны с помощью виртуального препарирования, чтобы получить изображения, аналогичные грубому рассечению. В отличие от грубой диссекции образцов сердца, плоскости разреза при виртуальном рассечении практически не ограничены. Практически любой вид может быть воссоздан для визуализации интересующих структур по мере необходимости.
8. 3D-печать
   1. Откройте совместимый файл образца сердца в программном обеспечении 3D-принтера.
   2. Используйте профиль 0,10 мм Fast DETAIL для печати настроек в 3D-принтере и уменьшите скорость печати до 20 мм/с. Включите параметр Создать вспомогательный материал.
   3. Используйте профиль нити ТПУ для «Настроек нити» на 3D-принтере.
   4. Используйте профиль сопла Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 для "Настроек принтера" в принтере.
   5. После завершения нарезки сохраните файл BGCODE на USB-накопителе для 3D-печати.
   6. Используйте нить ТПУ толщиной 1,75 мм для 3D-печати образца человеческого сердца. Перед 3D-печатью высушите нить из ТПУ в течение 6 часов с помощью сушилки для филамента.
   7. Чтобы уменьшить натяжение нити во время 3D-печати, поместите катушку с нитью на держатель катушки со встроенным подшипником, чтобы облегчить вращение катушки с нитью. Выполняйте 3D-печать с помощью коммерчески доступного 3D-принтера с текстурированным стальным листом с порошковым покрытием.
   8. Осторожно снимите вспомогательные материалы после завершения 3D-печати.

Результаты

Микромасштабные исследования
Применение очистки тканей позволяет визуализировать большие объемы ткани в 3D с помощью конфокальной микроскопии. В сердце можно визуализировать ганглии, содержащие сердечные нейроны, и нейронный паттерн иннервации миокарда (рис. 2

Обсуждение

Настоящее исследование демонстрирует всеобъемлющий конвейер для анализа образцов, полученных из целых человеческих сердец. Репрезентативные результаты показывают микро- и макромасштабные анатомические исследования, проводимые регулярно для одного сердца. Поскольку образец челове?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN