JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол основан на ЛПС и АТФ-индуцированной гибели PMA-дифференцированных макрофагов THP-1. Мы используем проточную цитометрию для анализа аннексина V и двойное окрашивание 7-AAD для выявления гибели клеток, используя всю клетку и сканирующую электронную микроскопию для наблюдения за морфологией клеточной мембраны.

Аннотация

Гибель клеток является фундаментальным процессом во всех живых организмах. Протокол устанавливает индуцированное липополисахаридом (ЛПС) и аденозинтрифосфатом (АТФ) дифференцированное отложение липидов в модели моноцитов человека (ТГП-1) для наблюдения за гибелью клеток. ЛПС в сочетании с АТФ является классическим методом индукции воспаления, часто используемым для изучения пироптоза, но апоптоз и некроптоз также реагируют на стимуляцию ЛПС/АТФ. В нормальных условиях фосфатидилсерин локализуется только во внутреннем листке плазматической мембраны. Однако на ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза клеточная мембрана остается неповрежденной и подвергается воздействию фосфатидилсерина, а на более поздних стадиях клеточная мембрана теряет свою целостность. Здесь с помощью проточной цитометрии анализировали двойное окрашивание аннексина V и 7-аминоактиномицина D (AAD) с целью выявления гибели целых клеток. Результаты показывают, что значительные клетки погибли после стимуляции ЛПС/АТФ. С помощью сканирующей электронной микроскопии мы наблюдаем возможные формы клеточной гибели в отдельных клетках. Результаты показывают, что клетки могут подвергаться пироптозу, апоптозу или некроптозу после стимуляции ЛПС/АТФ. Этот протокол направлен на наблюдение за гибелью макрофагов после стимуляции ЛПС/АТФ. Результаты показали, что гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ не ограничивается пироптозом и что апоптоз и некротический апоптоз также могут происходить, что помогает исследователям лучше понять гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ и выбрать лучший экспериментальный метод.

Введение

Гибель клеток является фундаментальным физиологическим процессом во всех живых организмах. В последние годы серьезные исследования показали, что гибель клеток влияет на иммунитет и баланс в организме. Изучение клеточной смерти помогает нам лучше понять возникновение и развитие заболеваний. Было описано несколько форм запрограммированной клеточной смерти, и были определены некоторые ключевые мишени в этих процессах. Пироптоз, апоптоз и некроптоз являются тремя генетически определенными запрограммированными путями гибели клеток, участвующими во внутреннем балансеи заболевании.

Пироптоз характеризуется образованием мембранных пор и выделением содержимого клеток. Активированные каспазы или гранзимы расщепляют гасдермины, разделяя их N-концевые домены, которые затем олигомеризуются, связываются с мембраной и образуют поры 2,3,4. Пора гасдермина обеспечивает атипичный канал секреции через клеточные мембраны, что приводит к нисходящим реакциям клеток, включая высвобождение содержимого и приток ионов 2,3,4. В конечном счете, клетки в конечном итоге испытывают разрыв плазматической мембраны и пироптотический лизис, чему способствует нинджурин-15. При апоптозе активированные Bax и Bak образуют олигомеры на внешней мембране митохондрий и высвобождают цитохром С, который регулируется балансом между проапоптотическими и антиапоптотическими белками семейства BCL-2, инициирующими каспазами (каспазами-8, -9 и -10) и эффекторными каспазами (каспазами-3, -6 и -7)1,6,7. Морфологические изменения апоптоза включают блеббинг мембраны, усадку клеток, фрагментацию ядер, конденсацию хроматина и образование апоптотических тел 6,8. Рецептор-взаимодействующая серин/треонин-протеинкиназа 1 (RIPK3) и доменоподобная киназа смешанной линии (MLKL) являются двумя основными компонентами механизма некроптозы1. RIPK3 рекрутирует и фосфорилирует MLKL, p-MLKL олигомеризуется, связывается с клеточной мембраной, инициирует перфорацию мембраны, вызывает приток ионов, увеличивает внутриклеточную осмолярность и, в конечном итоге, разрыв клетки 6,9. Гасдермины и MLKL связываются с плазматической мембраной и опосредуют пироптоз и некроптоз соответственно, в то время как BAX/BAK опосредует апоптоз, связываясь с внешней мембраной митохондрий.

Хотя каждый путь имеет определенные механизмы и результаты, они приводят к аналогичным изменениям на клеточной мембране. В нормальных условиях фосфатидилсерин (ФС) локализуется только во внутренней створке плазматической мембраны. Однако на ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза ФС будет подвергаться воздействию за пределами плазматической мембраны. Каспазы-3/каспазы-7 активируют семейства TMEM16 и XKR, что приводит к асимметричной клеточной мембране и экстернализирует PS во время апоптоза10. D-опосредованный гасдермином и MLKL-опосредованный притокCa2+ приводит к потере симметрии фосфолипидного бислоя на клеточной мембране и облучению PS. Воздействие происходит до потери целостности клеточной мембраны11,12. Основываясь на схожих изменениях в мембране этих трех типов запрограммированной клеточной гибели, мы используем проточную цитометрию для анализа двойного окрашивания аннексина V/7-аминоактиномицина D (7-AAD) для выявления клеточной гибели. Аннексин V, кальций-зависимый фосфолипид-связывающий белок, обладает высоким сродством к PS, который может служить чувствительным зондом для обнаружения экспонированного PS на поверхности плазматической мембраны13. 7-AAD представляет собой краситель нуклеиновой кислоты, который не может пройти через всю клеточную мембрану. Он похож на йодид пропидия (PI), широко используемый краситель нуклеиновой кислоты. Они имеют схожие флуоресцентные характеристики, но 7-AAD имеет более узкий спектр излучения и меньше помех другим каналам обнаружения. Из-за этих сходств недостаточно различать пироптоз, апоптоз и некроптоз. Мы использовали проточную цитометрию для обнаружения гибели клеток из целых клеток. Второй метод используется для захвата клеточной мембраны с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для наблюдения за возможными формами клеточной гибели в отдельных клетках.

Мы установили липополисахаридное (ЛПС) и аденозинтрифосфат (АТФ), индуцированное форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА)-дифференцированное отложение липидов в модели моноцитов человека (ТГП-1) для наблюдения за гибелью клеток. Этот протокол сосредоточен на наблюдении за гибелью клеток, а не на исследовании механизмов.

протокол

1. Клеточная линия и клеточная культура

  1. Выращивание моноцитарной клеточной линии человека THP-1 в питательной среде RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола. Культивируйте клетки при температуре 37 °C в увлажненном воздухе с содержанием 5%CO2 . Субкультура клеток каждые 2-3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: THP-1 - это суспензионная ячейка, выбранная для замены половины среды для субкультивирования. При наблюдении большого количества фрагментов клеток под световым микроскопом центрифугируйте при 300 х g в течение 3 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки в предварительно подогретой свежей среде для культивирования клеток.
  2. Для всех экспериментов используйте клетки (в отрывках 4-10) в фазе логарифмического роста. Когда клетки находятся в хорошем состоянии и логарифмической фазе роста, они круглые, яркие, плотные и без сгустков и фрагментов клеток под световым микроскопом при 100-кратном увеличении.

2. Дифференцировка клеток THP-1

  1. Приготовьте стоковый раствор ПМА с концентрацией 1 мМ (растворите 1 мг РМА в 1,62 мл диметилсульфоксида). Разбавить стоковый раствор PMA полной средой для культивирования клеток до конечной рабочей концентрации 100 нМ.
  2. Соберите клетки в чашке для культивирования в стерильную центрифужную пробирку объемом 10 мл. Центрифугировать при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре, ресуспендировать клетки 3 мл полной питательной среды, содержащей РМА.
  3. Откройте счетчик ячеек и программное обеспечение для подсчета. Нанесите пипеткой 20 мкл клеточной суспензии на плату счетчика клеток и вставьте ее в плату счетчика клеток. Нажмите «Предварительный просмотр B1», поверните ручку в правом нижнем углу прибора и отрегулируйте фокусное расстояние, чтобы ячейки с ярким центром и четкими контурами были в программе. Нажмите Подсчитать , чтобы начать подсчет.
  4. Основываясь на результатах подсчета, используйте полную питательную среду, содержащую PMA, для регулировки плотности клеток до 1 x 106 клеток/мл. Засейте клетки в 6-луночной тарелке, инкубируйте в планшете в течение 24 ч при 37 °C и 5%CO2 перед началом дальнейшей обработки.

3. Лечение ТГП-1клетками

  1. Приготовьте стоковый раствор ЛПС с концентрацией 1 мг/мл (растворите 1 мг ЛПС в 1 мл фосфатно-солевого буфера (ПБС)). Разбавить исходный раствор ЛПС средой, не содержащей сыворотки, до конечной рабочей концентрации 1 г/мл. Приготовьте стоковый раствор Na2АТФ с концентрацией 500 мМ (растворите 0,3026 г АТФ в 1 мл PBS).
  2. Отсадите из лунок среду, содержащую PMA, и промойте PBS 1x. Добавьте бессывороточную среду в контрольную группу и бессывороточную среду, содержащую ЛПС, в модельную группу. Инкубируйте планшет в течение 6 часов при 37 °C + 5%CO2 , прежде чем приступить к дальнейшей обработке.
  3. Через 6 ч добавьте исходный раствор АТФ в модельную группу до конечной рабочей концентрации 500 нМ. Перед началом работы инкубируйте планшет в течение 45 минут при температуре 37 °C + 5%CO2 .

4. Анализ проточной цитометрии (Метод 1)

  1. Подготовка экспериментальных образцов
    1. Засейте и инкубируйте клетки в 6-луночных планшетах в соответствии с шагом 2. Установите четыре контрольные группы без обработки: одну контрольную группу без окрашивания, две контрольные группы с одинарным окрашиванием (по одной для каждого окрашивания) и одну контрольную группу с двойным окрашиванием. Определите одну группу лечения и проводите лечение в соответствии с шагом 3.
    2. После обработки аспирируйте всю надосадочную жидкость из лунок и промойте PBS 2x. Добавьте 500 мкл 0,05% трипсина (не ЭДТА) в каждую лунку и инкубируйте в инкубаторе в течение 30 с.
    3. Добавьте 1 мл полной питательной среды RPMI-1640 в каждую лунку, чтобы остановить отслоение клеток, и соберите клетки в пробирку объемом 5 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
    4. Добавьте 1 мл PBS для ресуспендирования клеток. Поместите пробирки с ячейками на водяную баню при температуре 37 °C на 3 минуты. Центрифугируйте все образцы при плотности 300 x g в течение 3 минут при комнатной температуре.
    5. Разбавьте 200 мкл 5x связывающего буфера с 800 мкл дистиллированной воды до 1x связывающего буфера. Добавьте 100 мкл 1x связывающего буфера для ресуспендирования клеток и перенесите клетки в пробирку объемом 5 мл.
    6. Добавить 5 мкл раствора Аннексина V-PE в одну пробирку клеток контрольной группы в течение 10 мин и 5 мкл раствора 7-AAD в другую пробирку клеток контрольной группы в течение 5 мин (в качестве одиночного окрашивания контрольных клеток отдельно). Аккуратно перебейте каждую пробирку, смешайте краситель и инкубируйте образцы при комнатной температуре, защищенной от света. Добавьте 400 μL PBS в каждую пробирку и осторожно сделайте вихрь, чтобы завершить инкубацию.
    7. Добавьте 5 μL раствора Аннексина V-PE в оставшиеся пробирки и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Аккуратно перебейте каждую пробирку, смешайте краситель и инкубируйте образцы при комнатной температуре, защищенной от света. Через 5 минут добавьте 5 μL раствора 7-AAD на 5 минут при комнатной температуре. Добавьте 400 μL PBS в каждую пробирку и осторожно сделайте вихрь, чтобы завершить инкубацию.
    8. Отфильтруйте клеточную суспензию с помощью нейлоновой сетки толщиной 35 мкм, которая входит в состав полистирольных пробирок с круглым дном объемом 5 мл. Поместите пробирку на лед и дождитесь тестирования. Аккуратно перемешайте перед тестированием, а затем вставьте его в инструмент.
  2. Проточная цитометрия
    1. Для тестирования используйте проточный цитометр для сортировки клеток, активируемый флуоресценцией. Откройте программное обеспечение для анализа данных проточного цитометра и убедитесь в работоспособности детектора и лазера. Нажмите на Цитометр и выберите Fluidics startup, подождите, пока система будет готова. Исключите пузырьки в проточной камере, нажав на «Цитометр» > «Режимы очистки» > ячейке «Дегазация».
    2. Нажмите кнопку Experiment, выберите в последовательности Новая папка, Эксперимент, Образец, Пробирка и Редактировать имя. Стрелка пятиугольной формы перед трубкой становится зеленой, когда загорается.
    3. Нажмите на иконку цитометра FACSCelesta (иконка клавиши быстрого доступа), выберите Параметр, а затем выберите FSC, SSC и PE сигнал. Нажмите на иконку глобального рабочего листа (иконка клавиши быстрого доступа), чтобы построить гистограмму PE. Для проточного цитометра, используемого в этом исследовании, используйте ПЭ для аннексина V на длине волны 586 нм и построите график по оси X; PerCP-Cy5.5 для 7-AAD на длине волны 700 нм и построении графика по оси Y.
    4. Сначала вставьте в прибор неокрашенный контрольный образец. Нажмите на иконку Панели управления приобретениями (иконка клавиши быстрого доступа), получите минимум 10 000 событий от нужной популяции. Исключение мусора с помощью строба (P1) на точечной диаграмме FSC-A и SSC-A. Отрегулируйте расход на среднюю скорость и запишите данные. Отрегулируйте напряжение, чтобы поместить популяцию элементов по диагонали гистограммы FSC/SSC, и нажмите кнопку Перезапустить. Отрегулируйте расход на среднюю скорость и запишите данные.
    5. Нажмите Next tube, запустите одинарные регуляторы окрашивания Annexin V и 7-AAD для регулировки компенсации. Запустите оставшиеся пробирки и соберите данные.

5. Визуализация СЭМ (метод 2)

  1. Подготовка экспериментальных образцов
    1. Высевайте и инкубируйте клетки в 6-луночных планшетах в соответствии с этапом 2 и обрабатывайте в соответствии с этапом 3.
    2. После обработки отаспирируйте всю надосадочную жидкость из лунок и промойте 2 раза PBS. Добавьте 500 мкл 0,05% трипсина (не ЭДТА) в каждую лунку и инкубируйте в инкубаторе в течение 30 с.
    3. Добавьте 1 мл полной питательной среды RPMI-1640 в каждую лунку, чтобы остановить отслоение клеток, и соберите клетки в пробирку объемом 5 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
    4. Зафиксировать ячейки с помощью 500 мкл фиксатора электронного микроскопа (2,5% глутарового диальдегида, 100 мМ солей фосфора) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем провести ночь при 4 °С.
    5. Приготовьте раствор квасцов хрома: добавьте 1,0 г желатина в 100 мл сверхчистой воды, нагревая водяную баню 70 °C, и равномерно перемешайте. Добавьте 0,05 г квасцов хрома, равномерно перемешайте и процедите фильтровальной бумагой. Опустите чистое защитное стекло в раствор квасцов хрома на 2 часа при температуре 37 °C и высушите в духовке при температуре 37 °C для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы предотвратить отслоение клеток во время эксперимента.
    6. Соберите клетки из неподвижного раствора. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Добавьте 100 μL PBS и аккуратно продуйте клетки. Опустите подвес ячейки на покровное стекло, дайте постоять 5 минут. Отсадите всю надосадочную жидкость и промывайте 3 раза PBS в течение 5 минут каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Операцию необходимо проводить осторожно, чтобы предотвратить отслоение клеток. Не встряхивайте сильно, двигайтесь медленно и медленно добавляйте жидкость вдоль стены.
    7. Добавьте 500 мкл 1% фиксации осмиевой кислотой на 1 час. Отсадите всю надосадочную жидкость и промывайте 3 раза PBS в течение 5 минут каждый раз.
    8. Последовательно обезвоживайте образцы в нескольких концентрациях этанола (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) в течение 15 мин на раствор EtOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитные стекла можно хранить при 100% EtOH в течение нескольких дней при температуре 4 °C, но они должны высохнуть как можно скорее, чтобы избежать чрезмерного обезвоживания.
    9. Включите сушилку для критических точек, откройте бак CO2 , охладите камеру до 10 °C. Быстро оберните образец фильтровальной бумагой, когда давление в камере составит 0 фунтов на квадратный дюйм, и поместите его в камеру.
    10. Откройте впускной клапан, понаблюдайте через смотровое окно CO2 , поднимите уровеньCO2 жидкости между двумя красными линиями (не превышайте верхний предел), закройте впускной клапан. Замочите образец на 10 минут. Откройте впускной и выпускной клапаны одновременно, чтобы выровнять CO2 в течение 1 мин (жидкий CO2 вытесняет EtOH). Закройте выпускной клапан, чтобы поднять уровеньCO2 жидкости до указанного положения, закройте впускной клапан.
    11. Установите температуру 35 °C и давление 1250 фунтов на квадратный дюйм. Как только температура и давление стабилизируются, сбросьте давление со скоростью 100 фунтов на квадратный дюйм/мин. Извлеките пробу, когда давление в камере равно нулю, и выключите прибор.
    12. Монтируйте образцы на держатели из алюминия SEM с помощью проводящей ленты. С помощью распылительной коатерки покройте образцы слоем золота (2-5 нм).
  2. Отображение
    1. Используйте СЭМ излучения холодного поля с высоким разрешением для визуализации. Установите ускоряющее напряжение РЭМ на 3 кВ. Установите рабочее расстояние на 10 мм. Установите увеличение на 1 000x, чтобы наблюдать за панорамой. Установите увеличение на 5 000x и 20 000x, чтобы найти плазматическую мембрану и получить изображение образца.
      Примечание: Процесс визуализации PMA-дифференцированных макрофагов THP-1 с помощью SEM аналогичен другим типам клеток и тканей и зависит от используемых инструментов. В ссылке14 представлен подробный протокол SEM с сопровождающими видео.

Результаты

Образцы клеток обрабатывались в соответствии с описанием протокола и проводилась проточная цитометрия. Нормальные клетки нельзя окрашивать Аннексином V и 7-AAD (Аннексин V-/7-AAD-). На ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза PS подвергался воздействию и связывался с аннексином V, но кл...

Обсуждение

В данной рукописи были использованы два метода для выявления ЛПС и АТФ-индуцированной гибели РМА-дифференцированных макрофагов ТГП-1. Использовали двойное окрашивание аннексином V/7-AAD, результаты которого анализировали с помощью проточной цитометрии из общего окрашивания. Как и при др...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Выражаем огромную благодарность Цзяи Сунь и Лу Яну из Инновационного института китайской медицины и фармации Университета традиционной китайской медицины Чэнду за помощь в проведении проточной цитометрии, Цуйпин Чэню из Государственной ключевой лаборатории ресурсов юго-западной китайской медицины за помощь в проведении сканирующей электронной микроскопии. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая [82104491], Фондом естественных наук провинции Сычуань [2023NSFSC0674] и Фондом постдокторантуры Китая [2021M693789].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom TubeCORNING352235
5 mL centrifuge tubeLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
6-well plate Sorfa Life Science Research Co.,Ltd220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kitAbsin (Shanghai) Biological Technology co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubatorEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N/A
cell culture dish, 100 mmSorfa Life Science Research Co.,Ltd230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell CounterNexcelom Bioscience LLCCellometer K2
Cellometer SD100 Counting ChambersNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
centrifuge machineHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
chromium alum Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA04354
cover glasses, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
critical point dryerQuorum TechnologiesK850
dimethyl sulfoxideBOSTER Biological Technology co.ltdPYG0040
electron microscope fixativeServicebio Technology co.ltd G11022.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balanceSHIMADZUATX124
ethanol absoluteChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021033102
flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-2106
flow cytometry analysis softwareBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Software
gelatinGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
High resolution cold field emission scanning electron microscopeTITACHIRegulus 8100
human monocytic cell line THP-1Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.CL0233
inverted microscope Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vortex MixerVELP Scientifica SrlZX4
lipopolysaccharide Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. L8880LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. P6741
phosphate-buffered salineServicebio Technology co.ltd G4202
PipetteEppendorf AGN/A
pipette tips, 10 μLServicebio Technology co.ltd T-10PL
pipette tips, 1 mL Servicebio Technology co.ltd T-1250L
pipette tips, 200 μLServicebio Technology co.ltd T-200L
RPMI-1640 complete culture mediaProcell Life Science&Technology Co.,Ltd.CM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.K211104
sheath fluidBECKMAN COULTER8546733
sputter coaterCressington Scientific Instruments Ltd108
thermostatic water bathGUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd HH-1

Ссылки

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
  3. Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803 (2023).
  4. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  5. Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
  6. Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378 (2022).
  7. Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
  8. Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772 (2020).
  9. Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
  10. Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
  11. Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
  12. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
  13. Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
  14. JoVE, Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , (2024).
  15. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
  16. Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
  17. Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
  18. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  19. Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48 (2018).
  20. Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830 (2022).
  21. Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233 (2018).
  22. Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689 (2019).
  23. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  24. Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515 (2015).
  25. Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529 (2024).
  27. Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
  28. Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1V7 D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены