Модель стероид-индуцированного остеонекроза головки бедренной кости у крыс без напряжения

Резюме

В протоколе показано построение простой и экономически эффективной модели тренировки крыс с нагрузкой при стероид-индуцированном остеонекрозе головки бедренной кости с использованием эластичной терапевтической ленты.

Аннотация

В отличие от человека, крысы – это животные, которые ходят на четвереньках, в то время как люди – двуногие животные, которые стоят, и бедра подвергаются колоссальному давлению при ходьбе и стоянии. В моделях некроза головки бедренной кости, индуцированного стероидами у крыс, часто необходимо моделировать биомеханические характеристики бедра человека при более высоком давлении. Некоторые ученые пытаются имитировать состояние давления на бедра человека, заставляя крыс нести определенный вес, но зафиксировать несущий вес объект на крысе сложно. Крысы могут легко освободиться от обездвиживания, а приклеивание груза к крысам с помощью клейкой ленты приведет к тому, что крысы задохнутся или умрут от кишечной непроходимости. Наша исследовательская группа использовала эластичную лечебную ленту для проведения иммобилизации без натяжения несущих предметов у крыс, чтобы крысы могли свободно дышать и не отрываться от иммобилизации в условиях нагрузки. По сравнению с обычной моделью некроза головки бедренной кости, вызванной стероидами, мы обнаружили, что это вмешательство с нагрузкой может усугубить прогрессирование некроза головки бедренной кости у крыс.

Введение

Применение глюкокортикоидов является наиболее распространенным фактором риска развития нетравматического остеонекроза головки бедренной кости (ОНФГ)¹. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что, помимо глюкокортикоидов, нагрузка на тазобедренный сустав у пациентов также связана с возникновением ОНФГ. Такие факторы, как масса тела и интенсивность физического труда, признаны факторами риска развития ОНФГ². Многочисленные клинические исследования продемонстрировали тесную связь между нагрузкой на тазобедренный сустав и сроками и частотой замены суставов 3,4,5,6. Таким образом, создание модели, отражающей взаимосвязь между нагрузкой и стероид-индуцированным остеонекрозом головки бедренной кости (СОНФГ), важно для всестороннего исследования этого состояния.

Крупные двуногие птицы, такие как страусы и эму, служат хорошими моделями для имитации нагрузки на тазобедренный сустав, напоминая нагрузки на человеческие ноги ^7,8. Тем не менее, поддержание крупных видов птиц является сложной задачей, а связанные с этим затраты на исследования высоки. У крыс со спонтанной гипертензией модели ^9,10 могут наблюдаться более высокие показатели ОНФГ, но нагрузка на компартментное давление в костном мозге, создаваемая спонтанной гипертензией, существенно отличается от механического давления и не подходит для изучения влияния механического давления на СОНФГ.

Модели мелких животных обычно используются в исследованиях SONFH. Тем не менее, четвероногие рептилии имеют меньшую нагрузку на тазобедренные суставы, и их модели тазобедренных суставов не могут имитировать биомеханическую среду тазобедренных суставов человека во время двуногой ходьбы. Модели¹¹ с одной конечностью и модели¹² с частичной разгрузкой являются распространенными, но обе модели снижают нагрузку на конечности. Поскольку люди являются двуногими организмами со значительными нагрузками на нижние конечности при стоянии и ходьбе, снижение нагрузки в этих моделях уменьшает связь между животными моделями и болезнями человека.

Данное исследование направлено на создание простой и экономически эффективной модели тренировки с весовой нагрузкой для изучения влияния тренировок с отягощениями на индуцированный стероидами остеонекроз головки бедренной кости у крыс. В настоящее время для изучения стероид-индуцированного остеонекроза головки бедренной кости^13,14 использовались модели на крысах, но до сих пор нет модели, способной обеспечить длительную, безопасную фиксацию с минимальным нарушением движения, что также является относительно простым и недорогим. В этом исследовании применяется фиксационный материал с высокой адгезией, обеспечивающий фиксацию без натяжения, которая сохраняет подвижность крыс и уменьшает страдания и даже смерть, вызванные неправильной фиксацией.

протокол

Протокол соответствует этическим принципам, установленным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Пекинского университета китайской медицины, номер протокола BUCM-4-2022062001-2109. В протоколе используются крысы Sprague Dawley (SD) (SCXK(Jing)2019-0008) в возрасте 8-10 недель и массой 200-250 г.

1. Адаптационный тренинг

1. Крысы-альбиносы обычно имеют визуальный диапазон менее 60 см¹⁵. В процессе моделирования поместите крыс в непрозрачные клетки и держите их как можно дальше от немоделируемых крыс (по крайней мере, другие крысы должны находиться за пределами максимального визуального диапазона моделируемых крыс), чтобы предотвратить их травматический стресс.
2. Включите мощность и установите беговую дорожку на 10 м/мин с наклоном 0°. Поместите крыс на беговую дорожку и убедитесь, что движения максимально мягкие, чтобы избежать стресса. Не используйте дополнительную стимуляцию; Крысы естественно будут ползти вперед, потому что они незнакомы с окружающей средой.
3. Тренировка длится 15 минут. После тренировки уберите кал и мочу, оставленные крысами, и распылите спирт для устранения животного запаха. Затем подготовьте следующую крысу к дрессировке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если крыса отказывается ходить по беговой дорожке в течение 5 минут, исключите ее из исследования.
4. Продолжайте адаптивную тренировку до конца^1-й недели.

2. Измерение максимальной несущей способности у крыс

1. Подготовьте две пробирки, крючок и застежку-петлю длиной примерно 80 см. Поместите стальные шарики в пробирки, убедившись, что начальный общий вес пробирок, крючка и застежки-петли составляет 150 г. Приготовьте пробирки с разным общим весом с шагом 10 г, максимальный вес 350 г.
2. Исследователь использует обе руки, чтобы пристегнуть крыс с помощью перчаток (рис. 1). Другой исследователь помещает пробирку на спину крысы примерно в 1 см от средней линии спины. Поскольку этот этап не требует движения крысы, выполните фиксацию, просто обернув застежку-липучку вокруг крысы без использования дополнительных мер по закреплению трубки.
3. Меняйте трубку до тех пор, пока не будет достигнут максимальный вес крысы. Когда крыса достигает максимальной нагрузки, она не может стоять, когда ее толкают или экспериментатор уходит. Уменьшите вес на 10 г, чтобы крыса могла стоять. Этот вес представляет собой максимальную несущую способность крысы.

3. Подготовка весового груза

1. Так как во время тренировок требуется надежная фиксация, обезопасьте объекты с помощью эластичной лечебной ленты длиной 1-1,5 м, исходя из размера крысы, которая обладает прочной адгезией. Используйте глину для регулировки веса пробирок, чтобы уменьшить раскачивание груза.
2. После взвешивания веса пробирок и фиксирующих объектов добавьте в пробирки соответствующее количество глины, чтобы отрегулировать их до целевого веса. С помощью стеклянной палочки для перемешивания равномерно распределите глину внутри пробирок. Глина, сконцентрированная на одном конце пробирки, может привести к тому, что она легко отсоединится во время тренировки.
3. Отрегулируйте общий вес отрегулированных пробирок и глины на уровне 50% от максимальной несущей способности крысы (рисунок 1A). Превышение этого веса затруднит крысе завершение обучения. Не регулируйте вес груза снова до окончания эксперимента.

4. Установление стероид-индуцированного остеонекроза модели головки бедренной кости

1. Используйте метод метилпреднизолона в сочетании с липополисахаридом (ЛПС+МПС) для создания модели SONFH^16,17. Выполняйте внутрибрюшинное введение ЛПС (20 мкг/кг) с помощью стандартной иглы в среднюю линию живота крысы один раз в 24 ч, всего 2 инъекции.
2. После последней инъекции ЛПС введите МПС (40 мг/кг) в одностороннюю ягодичную мышцу через 24 ч после обычного кормления и продолжайте инъекции каждые 24 ч, чередуя две ягодичные области, всего три инъекции.

5. Иммобилизация без напряжения с использованием эластичной лечебной ленты и тренировка на беговой дорожке

1. Обозначьте среднюю линию спины крысы на расстоянии 1-2 см с обеих сторон; Это точка отсчета для весовой нагрузки. Убедитесь, что метки расположены правильно, чтобы крыса не опрокинулась и не смешала движениям во время тренировки на беговой дорожке.
2. Пока один следователь фиксирует крысу в перчатках, положите одну руку под мышку крысы, чтобы зафиксировать переднюю конечность и челюсть, в то время как другая рука фиксирует задние конечности и хвост. Избегайте чрезмерной силы, чтобы предотвратить стресс или удушье (Рисунок 1B).
3. Приклейте эластичную лечебную ленту к пробирке без натяжения, чтобы закрепить груз на спине крысы. В процессе намотки не растягивайте эластичную лечебную ленту, чтобы добиться фиксации без натяжения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая в данной модели эластичная лечебная лента предназначена для тейпирования при интенсивных физических нагрузках, обеспечивая высокую адгезию и эластичность¹⁸. Благодаря своей высокой эластичности он значительно снижает воздействие на движение крысы во время ползания.
4. Попросите второго исследователя закрепить пробирку на спине крысы параллельно позвоночнику крысы так, чтобы положение фиксации основывалось на сделанной разметке, т.е. на расстоянии 1-2 см от средней линии по обе стороны от спины крысы.
5. Чтобы свести к минимуму страдания крысы, уменьшить воздействие на движения крысы и снизить смертность от фиксации, выполняйте фиксацию без приложения напряжения. Наклейте пробирку с отрегулированным грузом на эластичную терапевтическую ленту, затем оберните пробирку вокруг тела крысы методом без натяжения.
6. Обеспечьте иммобилизацию без натяжения и сохраняйте первоначальную длину эластичной лечебной ленты без растяжения, чтобы предотвратить любое неблагоприятное воздействие на дыхание и движение крысы (Рисунок 1C).
7. Обернув пробирку вокруг тела крысы, поместите крысу на открытое пространство или в одну клетку, следя за ее дыханием и направлением. При появлении признаков учащенного дыхания или открывания рта немедленно отпустите крысу, чтобы предотвратить удушье.
   1. Идеальная иммобилизация позволяет крысе свободно двигаться и выполнять такие действия, как питье, поднятие передних конечностей и кормление (Рисунок 1D). Если иммобилизация неудовлетворительна, временно отпустите и повторно обездвижьте через 20 минут, чтобы свести к минимуму стресс для крысы из-за повторяющихся иммобилизационных стимулов.
8. Включите мощность и установите беговую дорожку на 1 м/мин с наклоном 0°. Время тренировки на беговой дорожке составляет 30 минут. Аккуратно перенесите крысу на беговую дорожку и запустите таймер.
9. Не стоит давать крысе дополнительную стимуляцию. Если крыса не может завершить 30-минутную тренировку, поместите ее в клетку для 10-минутного отдыха, не снимая фиксацию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эластичная лечебная лента, используемая в этом исследовании, обладает отличной растяжимостью и адгезией. При правильном закреплении без натяжения долгосрочная фиксация не приведет к отсоединению пробирки или к удушью и смерти крысы.
10. После тренировки уберите кал и мочу, оставленные крысами, и распылите спирт для устранения животного запаха.
11. Избегайте того, чтобы описанные выше шаги были замечены другими крысами, и обращайтесь с животными как можно мягче, чтобы животные не издавали звуки, тем самым вызывая травматический стресс у других крыс.
12. Немедленно освободите крысу от фиксации после завершения тренировки (рисунок 1Е). Во время отпускания пальцами надавливайте на шерсть крысы, чтобы защитить ее, сводя к минимуму потерю шерсти во время отпускания (Рисунок 1F).

6. Группировка животных

1. Чтобы изучить влияние тренировок с весовой нагрузкой на SONFH, случайным образом разделите 60 крыс на четыре группы.
2. В контрольной группе не следует устанавливать общую стероид-индуцированную модель остеонекроза головки бедренной кости (СОНФГ) и не выполнять тренировки с весовой нагрузкой. В группе Контроль+Нагрузка проводите тренировку только с нагрузкой, не устанавливая стероид-индуцированный остеонекроз модели головки бедренной кости. В группе «Модель» установить стероид-индуцированный остеонекроз только модели головки бедренной кости. В группе «Модель+Нагрузка» выполняйте тренировку с весовой нагрузкой после установления стероид-индуцированного остеонекроза головки бедренной кости.

7. Эвтаназия и сбор образцов

1. Поместите крыс в камеру для эвтаназии мелких животных и введите достаточно углекислого газа, чтобы достичь концентрации выше 5%. Как только крысы потеряют сознание, введите дозу 0,3 мл/кг массы тела 20% раствора хлорида калия, всего 20 мл, путем внутрисердечной инъекции.
2. Следите за дыханием и сердцебиением крыс, чтобы убедиться, что они не испытывают боли или дискомфорта во время эвтаназии. Подтвердите смерть, проверив на отсутствие дыхания и сердцебиения. Распылите спирт, чтобы удалить любой запах.
3. После эвтаназии рассеките тазобедренную область крысы и удалите головку бедренной кости, сохранив бедренную кость нетронутой. После предварительной обработки выполните микрокомпьютерную томографию с последующим окрашиванием гематоксилин-эозином (ПЭ).

8. Окрашивание гематоксилин-эозином

1. После того, как моделирование будет завершено, усыпьте крыс. Удалите бедренные кости для окрашивания HE.
2. Замочите бедренные кости крысы в 4% параформальдегиде на 24 часа, чтобы сохранить биологические ткани в качестве образцов. Замочите образцы бедренных костей крысы в 5% муравьиной кислоте для декальцинации на 5 дней.
3. Образцы разрезаются на срезы размером 5 мкм для окрашивания HE.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые лакуны относятся к ситуации в костной ткани¹⁹, когда лакуны, которые в норме должны содержать остеоциты, лишены этих клеток. Это важный показатель для оценки здоровья костной ткани. При патологическом процессе некроза костей недостаточное кровоснабжение может стать причиной гибели остеоцитов, приводящей к образованию пустых лакун. При диагностике и оценке некроза костей количество и распределение пустых лакун являются важными параметрами для измерения тяжести заболевания^20,21.
   1. Поместите образцы бедренных костей крыс в расплавленный парафин (56-60 °C), сначала замочив в парафине с низкой температурой плавления, если это необходимо, затем постепенно перекладывайте на парафин с более высокой температурой плавления, каждый раз примерно на 1 ч, чтобы обеспечить тщательную инфильтрацию ткани парафином.
   2. Подготовьте закладные формы и залейте в формы расплавленный парафин на соответствующую глубину. После замачивания извлеките образцы ткани из парафина с помощью щипцов, удалите излишки парафина и поместите их в формы. Остудите до комнатной температуры, чтобы парафин застыл, образовав парафиновые блоки.
   3. С помощью парафинового микротома разрежьте заложенные парафиновые блоки на участки толщиной 5 мкм.
4. Запекайте образцы бедренной кости крысы с прикрепленными ломтиками в подогревателе в течение 1 часа, чтобы усилить адгезию между срезами и покровным стеклом и уменьшить всплытие во время последующих процессов окрашивания.
5. Погрузите запеченные ломтики последовательно в чистый ксилол для удаления парафина, после чего последует серия обезвоживания с помощью абсолютного этанола, градиентного этанола (100%, 95%, 80%, 70%) и воды на 2 минуты каждый, завершив процесс депарафинизации и регидратации.
6. Опустите депарафинизированные ломтики в раствор для окрашивания гематоксилина и окрашивайте на 10 минут. Промойте проточной водой, чтобы удалить несвязанный гематоксилин.
7. Погрузите окрашенные гематоксилином участки в раствор для окрашивания эозина и окрашивайте на 2 мин для окрашивания цитоплазмы и соединительной ткани. Прополаскивается 1% раствором уксусной кислоты для закрепления эффекта окрашивания.
8. Погрузите образцы бедренной кости крысы последовательно в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% этанол с каждым градиентом на 2 минуты, постепенно удаляя влагу.
9. Погрузите образцы бедренной кости крысы в чистый ксилол для прозрачности, а затем промойте проточной водой для удаления ксилола. Нанесите нейтральную монтажную смолу, покрывая слайды, аккуратно постукивая, чтобы удалить пузырьки воздуха, и дайте монтажной среде застыть, чтобы завершить процесс монтажа.
10. Используя рандомизированный пакет в R, выберите 30 HE-окрашенных слайдов для каждой группы и распределите по 15 слайдов для двух исследователей. Не сообщая им о группах, попросите исследователей рассчитать количество пустых лакун на предметных стеклах и собрать результаты для статистического анализа.

9. Микрокомпьютерная томография

1. После того, как моделирование будет завершено, усыпьте крыс. Удалите бедренные кости для окрашивания гематоксилином-эозином.
2. Замочите бедренные кости крысы в 4% параформальдегиде на 24 часа, чтобы сохранить биологические ткани в качестве образцов. Поместите бедренные кости крысы в аппарат микрокомпьютерной томографии для мелких животных.
3. Установите следующие условия сканирования микрокомпьютерной томографии: Рентгеновское напряжение: 80 кВ, Ток: 100 μА, Время однократного воздействия: 50 мс, Разрешение сканирования: 25 μм. Выполняйте сканирование с интервалом 0,5°, уделяя особое внимание трабекулярной кости от хряща до верхней части эпифиза как области интереса.
4. Определите область над шейкой бедра крысы в качестве области интереса.
5. Выполните реконструкцию результатов сканирования в корональной плоскости с помощью аппарата микрокомпьютерной томографии и соберите морфометрические измерения кости, полученные с помощью встроенного программного обеспечения аппарата микрокомпьютерной томографии. Запишите следующие наблюдаемые индексы: Общий объем (TV), Процент костного объема (BV/TV), Отношение костной поверхности/объема (BS/BV), Толщина структуры (Tb.Th), Разделение структуры (Tb.Sp), Количество костей (Tb.N), Плотность костной ткани (BD).

10. Статистический анализ

1. Представьте данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD). Проведение статистического анализа для микро-КТ и количественной гистологической оценки с использованием независимого выборочного t-критерия. Рассмотрим p-значение < 0,05 как статистически значимое.

Результаты

Гистопатологический анализ
Окрашивание гематоксилином и эозином показало, что в контрольной группе и группе контроль+нагрузка костные трабекулы были неповрежденными и располагались регулярно. Эндотелиальные клетки кровеносных сосудов присутствовали в ...

Обсуждение

В настоящее время различные животные, такие как кролики²⁵, крысы²⁶, мыши²⁷, свиньи²⁸, бройлеры²⁹, страусы⁸ и эму³⁰ , могут быть использованы для создания моделей некроза головки бедрен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7