JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описан способ интраназального введения агрегатов α-синуклеина. Этот метод дает представление о распространении α-синуклеина от обонятельной слизистой оболочки к обонятельной луковице при болезни Паркинсона.

Аннотация

Болезнь Паркинсона (БП) — нейродегенеративное заболевание, характеризующееся наличием телец Леви, которые представляют собой агрегаты α-синуклеина (α-Syn). Недавно было высказано предположение, что болезнь развивается и прогрессирует за счет прионоподобного размножения агрегатов α-Syn из обонятельной луковицы (OB) или дорсального ядра блуждающего нерва. Хотя происхождение агрегатов α-Syn в OB остается неясным, недавно было высказано предположение об их распространении из обонятельной слизистой оболочки. Ранее мы показали, что интраназальное введение агрегатов α-Syn на мышиной модели индуцировало патологию α-Syn в OB мышей. В данном исследовании мы представляем способ интраназального введения агрегатов α-Syn, индуцировавших патологию α-Syn в ОВС мышей. Интраназальное введение агрегатов α-Syn является очень простым и понятным методом, и мы считаем, что он будет полезным инструментом в исследованиях для выяснения происхождения патологии α-Syn в OB и пути распространения α-Syn через обонятельную систему.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП), которая характеризуется двигательными симптомами, такими как брадикинезия, тремор в покое и ригидность мышц, является вторым по распространенности нейродегенеративным расстройством1. БП также проявляется немоторными симптомами, включая обонятельную дисфункцию, когнитивные нарушения, депрессию, галлюцинации, запоры и ортостатическую гипотензию. Его патологическими признаками являются гибель дофаминергических клеток в черной субстанции и наличие агрегатов α-синуклеина (α-Syn), называемых тельцами Леви2.

Следует отметить, что α-Syn представляет собой белок из 140 аминокислот, который существует в форме растворимого мономера (или тетрамера) в нормальных условиях. Однако в аномальных условиях растворимый мономер превращается в нерастворимые высокомолекулярные агрегаты, включая олигомеры и фибриллы. Сообщается, что переход α-Syn в олигомеры и фибриллы связан с клеточнойтоксичностью3.

Недавние исследования показали прионоподобное распространение агрегатов α-Syn между нейронами. Основываясь на многочисленных посмертных исследованиях, Braak et al. в 2003 году выдвинули гипотезу о том, что патология тельца Леви постепенно распространяется в мозге несколько стереотипным образом (гипотеза Браака)4,5. В 2008 году патологоанатомическое исследование пациентов с БП, перенесших трансплантацию среднего мозга плода, выявило тельца Леви в дофаминергических нейронах, полученных из тканей плода 6,7. Эти исследования показали, что агрегаты α-Syn могут распространяться от больного мозга к трансплантатам, что подтверждает гипотезу Браака.

После этих наблюдений эксперименты с использованием первичных нейронных культур и внутримозговой инъекции агрегатов α-Syn у мышей воспроизвели распространение агрегатов, подобных тельцу Леви, что является еще одним доказательством распространения α-Syn прионоподобным образом 8,9.

Braak et al. показали, что патология тельца Леви при БП начинается в обонятельной луковице (OB) и/или дорсальном ядре блуждающего нерва (dmX)4. Основываясь на гипотезе Браака, в нескольких исследованиях сообщалось о введении агрегатов α-Syn или экстрактов телец Леви из мозга пациентов с болезнью Паркинсона в OB и желудочно-кишечный тракт экспериментальных животных 10,11,12. В 2018 году исследование показало, что введение агрегатов α-Syn в OB мышей дикого типа индуцировало распространение патологии α-Syn по обонятельному пути, что приводило к обонятельной дисфункции13. Ранее мы инокулировали агрегаты α-Syn в OB трансгенных мышей α-Syn и обнаружили, что это приводит к атрофии гиппокампа и ухудшениюпамяти.

В 2022 году мы инокулировали агрегаты α-Syn в OB мартышек, небольшого нечеловекообразного примата; это приводило к распространению патологии α-Syn по обонятельному пути, атрофии OB и распространенному гипометаболизму глюкозы в головноммозге10.

Однако, если распространение агрегатов α-Syn происходит из OB, то возникает критический вопрос: по какому механизму первоначально появляются агрегаты α-Syn? Saito et al. ранее сообщали о наличии телец Леви в слизистой оболочке носа15. Наличие агрегатов α-Syn было обнаружено в слизистой оболочке носа пациентов с БП и множественной системной атрофией (МСА) с помощью анализа конверсии, индуцированной дрожанием в реальном времени (RT-QUIC)16. Примечательно, что анализ образцов слизистой оболочки носа у пациентов с расстройством поведения во сне с быстрым движением глаз (RBD), которое считается продромальной стадией БП, выявил повышение уровня α-Syn17. Это исследование показало, что патология α-Syn может существовать в слизистой оболочке носа даже в продромальной фазе БП.

Хотя эти результаты предполагают потенциальный путь от слизистой оболочки носа к акушерскому отделению, существуют ограниченные экспериментальные данные, подтверждающие этот сценарий. Чтобы восполнить этот пробел, мы вводили агрегаты α-Syn в носовую полость мышей и исследовали распространение патологии α-Syn от слизистой оболочки носа к акушерскому отделению. Наш экспериментальный подход показал, что однократное интраназальное введение агрегатов α-Syn мышам дикого типа индуцировало патологию α-Syn в OB, что дало экспериментальные доказательства пути распространения от слизистой оболочки носа к OB.

протокол

Для исследования были использованы мыши-самцы C57BL/6J в возрасте 2 месяцев. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с национальными рекомендациями. Комитет по исследованиям на животных Киотского университета предоставил этическое одобрение и разрешение на проведение этого исследования (MedKyo 23,544).

1. Интраназальное введение преформированных фибрилл α-Syn

  1. Приготовьте раствор мышиного α-Syn фибрилла в PBS (4 мг/мл) в соответствии с ранее описанными методами11. Оберните трубку прозрачной пленкой, чтобы предотвратить загрязнение.
  2. Ультразвуком 200 мкл раствора α-Syn фибрилл для получения предварительно сформированных фибрилл (PFF) α-Syn с помощью ультразвуковой обработки на водяной бане (Таблица материалов). Наполните ультразвуковую ванну водой и добавьте кубики льда для охлаждения до 4 °C для ультразвуковой обработки. Обрабатывайте фибриллы ультразвуком в течение 5 минут, каждый цикл состоит из 30 секунд ультразвуковой обработки с последующим интервалом 30 секунд (всего пять циклов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте средства индивидуальной защиты, такие как одноразовые перчатки, маска и защитные очки, чтобы предотвратить воздействие α-Syn.
  3. Подготовьте пипетку P10 (Таблица материалов) с наконечником для пипетки объемом 10 мкл. Обезболите каждую мышь комбинацией медетомидина гидрохлорида, мидазолама и буторфанола (MMB) путем внутрибрюшинного (внутримышечно) введения. Комбинированный анестетик MMB содержал мидазолам (0,3 мг/кг), медетомидин (4 мг/кг) и тартрат буторфанола (5 мг/кг). Используйте 0,005 мл/г внутримышечно при смешивании мидазолама (1 мг/мл) 0,3 мл, медетомидина (5 мг/мл) 0,8 мл, буторфанола тартрата (5 мг/мл) 1 мл и физиологического раствора 2,9 мл.
  4. Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что мыши полностью обезболились. Правильная анестезия может быть подтверждена, если мышь находится в боковом положении и не может встать на ноги. После обезболивания нанесите офтальмологическую мазь с помощью стерильного ватного аппликатора, чтобы предотвратить высыхание глаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Без анестезии, при введении назальных доз, трудно удерживать мышей в положении лежа на спине и правильно вводить раствор α-Syn, когда мыши чихают. По этим причинам была необходима седация.
  5. Поместите мышь под наркозом в положение лежа на спине. Подложите под тело бумажное полотенце или аналогичный материал, обеспечив небольшой наклон головы вниз (рисунок 1А, В). Такое положение препятствует быстрому поступлению введенного раствора α-Syn в легкие или пищевод, способствуя его задержке в носовой полости. Ноздри показаны на рисунке 1C.
  6. Наберите 1 мкл раствора α-Syn (4 мг/мл) в пипетку P10 и поместите наконечник пипетки рядом с носом мыши. Медленно сформируйте круглую каплю и держите ее на конце наконечника пипетки (рисунок 1D, красная стрелка). Интраназальное введение проводится для односторонней ноздри, используйте контралатеральную сторону в качестве контрольной.
  7. Поднесите каплю ближе к одной стороне ноздрей мыши и позвольте мыши вдохнуть ее естественным образом. Наблюдайте за вдохом и подождите от 30 с до 1 минуты (рисунок 1E).
  8. Повторите шаги 1.6.-1.7. до введения общего объема 20 мкл раствора α-Syn. После всех процедур выбросьте перчатки и протрите скамейку покупными моющими средствами, если поверхность загрязнена α-Syn
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться в защитном шкафу, чтобы предотвратить вдыхание α-Syn фибрилл персоналом, выполняющим процедуру. Предыдущее исследование показало, что объем 25 мкл является наиболее эффективным для введения лекарств через нос в мозг18. В настоящем исследовании мы использовали аналогичный объем 20 μл. Мы также используем ту же концентрацию PFF, что и для инъекции в OB в предыдущем отчете10, что близко к 400 мкМ (5,6 мг/мл) PFF19.
  9. Применяют атипамезол (3 мг/кг; Таблица материалов) Путем внутримышечного введения для обратного обращения медетомидина и облегчения выздоровления. Используйте 0,005 мл/г внутримышечно при смешивании атипамезола (5 мг/мл) 0,6 мл и физиологического раствора 4,4 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите обезболивание, потому что не до конца понятно, насколько стрессовым будет интраназальное введение α-Syn.
  10. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. После полного восстановления верните мышь в клетку.

2. Подготовка образцов

  1. Умерщвляйте обработанных мышей через 1, 3, 6 и 12 месяцев после интраназального введения преформированных фибрилл α-Syn.
    1. Поместите мышей в индукционный бокс, введите севофлуран (>6,5%) и продолжайте до тех пор, пока не произойдет остановка дыхания в течение > 60 с. Удалите мышей и проведите быстрое обескровливание путем разреза правого предсердия, чтобы обеспечить эвтаназию.
  2. Введите иглу 25G (Таблица материалов) в верхушку сердца. Перфузируйте мышь со скоростью 4 мл/мин 15 мл PBS, а затем 15 мл 4% PFA в PBS.
  3. Ножницами отрежьте голову и скальпелем сделайте надрез на волосистой части головы в 2 см. Надрежьте черепную кость ножницами с боковой стороны снизу к носу (рисунок 2А, Б). Чтобы получить OB, полностью удалите черепную кость на OB (Рисунок 2B, желтый круг).
  4. Переверните голову, разрежьте нервы мозга, а затем осторожно удалите мозг щипцами (рисунок 2В, Г). Получите мозг с интактными OB (рис. 2E). Чтобы получить неповрежденные OB, осторожно перережьте обонятельные нервы щипцами, поскольку OB прикрепляются к кости черепа (Рисунок 2D, желтый круг).
  5. Поместите образцы мозга в 4% PFA в PBS на ночь при температуре 4 °C. Не оставляйте образцы мозга более чем на 24 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная фиксация уменьшит иммуногистохимическое окрашивание. Если требуется длительное хранение, храните образцы мозга в 70% этаноле или PBS, содержащем 0,1% азида натрия для поддержания стерильности.

3. Иммуногистохимическое окрашивание OB

  1. Парафинизируйте образцы с помощью автоматического тканевого процессора (Таблица материалов), как описано ниже.
    1. Погрузите в 70% этанол на 120 минут, а затем погрузите в 100% этанол в 8 раз на 60 минут. Затем погрузите в 100% ксилол на 3 раза на 120 минут.
    2. Погрузить в парафин при температуре 60 °C на 120 мин с последующим погружением в парафин при 60 °C на 240 мин.
  2. Залейте образцы в парафин, как описано ниже.
    1. Погрузите образцы в парафин при температуре 60 °C с помощью модульного центра заделки тканей (Таблица материалов). Остудите их на льду.
  3. Разрежьте образцы на участки толщиной 8 мкм с помощью микротома (Таблица материалов)18.
  4. Выполните депарафинизацию, как описано ниже.
    1. Погрузите в 100% ксилол на 2x на 5 минут, а затем погрузите в 100% этанол на 2x на 3 минуты.
    2. Погрузить в 70% этанол на 3 мин. Постирать в PBS в течение 3 мин.
  5. Проведите забор антигена, как описано ниже.
    1. Погрузить в 100% муравьиную кислоту на 15 минут. Промойте в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 2 минут.
    2. Автоклав при 120 °C в течение 10 мин. Дайте ему остыть естественным образом.
  6. Погрузить в 1% перекись водорода в метанол на 10 мин. Стирать в PBS в течение 5 минут.
  7. Добавьте 500 μл 5% обезжиренного молока в PBS на предметных стеклах и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре.
  8. Поместите 500 мкл антифосфорилированного антитела α-Syn (p-α-Syn, 1/10000) в PBS на предметные стекла и инкубируйте их в течение ночи при 4 °C. Промыть 2 раза с PBS по 5 минут каждый.
  9. Инкубировать с универсальным полимером иммунопероксидазы, анти-Rabbit (Таблица материалов) в течение 1 ч при 25 °C. Промыть 2 раза с PBS по 5 минут каждый.
  10. Проявите с помощью набора для окрашивания 3,3'-диаминобензидином (DAB) (Таблица материалов) в течение 5 мин в соответствии с инструкциями производителя.
  11. Погрузить в раствор гематоксилина на 1 мин (Таблица материалов). Обесцвечивать в проточной воде в течение 10 минут.
  12. Выполните монтаж, как описано ниже.
    1. Погрузить в 70% этанол на 5 минут. Погрузите в 100% этанол на 2 раза на 5 минут.
    2. Погрузить в 100% ксилол на 2x на 5 минут. Монтаж осуществляется с помощью закладного носителя (Table of Materials). Нанесите на предметные стекла 100 μл закладной среды и накройте стеклянным покровным стеклом.
  13. Получение изображений с помощью микроскопа «Все в одном» с 20-кратным и 40-кратным увеличением (Таблица материалов).

Результаты

На рисунке 3 показано несколько примеров агрегатов α-Syn в OB. В настоящем исследовании мы вводили агрегаты α-Syn в одностороннюю ноздрю. Две носовые полости разделены носовой перегородкой, и каждый акушер проецирует обонятельные сенсорные нейроны в кажду...

Обсуждение

В предыдущем исследовании введение агрегатов α-Syn в носовую полость макак вызывало гибель дофаминергических клеток и отложение железа в черной субстанции, хотя агрегатов α-Syn не наблюдалось21. Сообщалось, что ежедневное введение агрегатов A53T человеческог...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Все эксперименты проводились при поддержке Риэ Хикавы. Мы выражаем нашу благодарность Ясуко Мацудзаве за оформление документов. Это исследование было поддержано JSPS KAKENHI (M.S., No. JP19K23779, JP20K16493 и JP20H00663).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710KEYENCEN/AAll-in-One microscope
Ampicillin Sodium SaltNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006AWater bath type sonicator.
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaWAK-52850
Cellulose tubeMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPShaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255Competent cell
EntellanSigma-Aldrich107961Rapid mounting medium for microscopy
Graefe Extra Fine Forceps Curved SerratedFST11152-10 forceps
Hardened Fine ScissorsFST14090-09scissors
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Universal Immuno-peroxidase Polymer, anti-Rabbit
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200New Brunswick scientific9105085Incubator shaker
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosideNacalai tesque19742-94
LB broth, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108Modular Tissue Embedding Center
Leica TP 1020Leica14 0422 85108Automatic Tissue Processor 
MedetomidineFuji Film135-17473
Microm HM325 Rotary MicrotomeThermo Scientific902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
New hematoxylin Type GMuto65-9197-38Hematoxylin solution
Normal winged needle for vein D type, 25GTERUMONN2332R25G needle
Optima TLX UltracentrifugeBeckman Couler8043-30-1197Ultracentrifuge
P10 pipetteGilsonFA10002P
ParaffinLeica39601095
paraformaldehydeNacalai tesque30525-89-4
Peroxidase Stain DAB KitNacalai tesque25985-50
Pirece BCA Protein Assay KitsThermo Scientific23225BCA assay
pRK172Addgene#134504Plasmid
Q-Sepharose Fast Flow. cytiva17051001Ion exchange resin

Ссылки

  1. Tysnes, O. B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 124 (8), 901-905 (2017).
  2. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nature Rev Neurosci. 2, 492-501 (2001).
  3. Conway, K. A., et al. Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's disease: implications for pathogenesis and therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (2), 571-576 (2000).
  4. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
  5. Braak, H., Rüb, U., Gai, W. P., Del Tredici, K. Idiopathic Parkinson's disease: possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. J Neural Transm (Vienna). 110 (5), 517-536 (2003).
  6. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
  7. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  8. Luk, K. C., et al. Pathological α-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  9. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  10. Sawamura, M., et al. Lewy body disease primate model with α-Synuclein propagation from the olfactory bulb. Mov Disord. 37 (10), 2033-2044 (2022).
  11. Uemura, N., et al. Inoculation of α-synuclein preformed fibrils into the mouse gastrointestinal tract induces Lewy body-like aggregates in the brainstem via the vagus nerve. Mol Neurodegener. 13 (1), 21 (2018).
  12. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  13. Rey, N. L., et al. Spread of aggregates after olfactory bulb injection of α-synuclein fibrils is associated with early neuronal loss and is reduced long term. Acta Neuropathol. 135 (1), 65-83 (2018).
  14. Uemura, N., et al. α-Synuclein spread from olfactory bulb causes hyposmia, anxiety, and memory loss in BAC-SNCA mice. Mov Disord. 36 (9), 2036-2047 (2021).
  15. Saito, Y., et al. Lewy body pathology involves the olfactory cells in Parkinson's disease and related disorders. Mov Disord. 31 (1), 135-138 (2016).
  16. De Luca, C. M. G., et al. Efficient RT-QuIC seeding activity for α-synuclein in olfactory mucosa samples of patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy. Transl Neurodegener. 8, 24 (2019).
  17. Stefani, A., et al. Alpha-synuclein seeds in olfactory mucosa of patients with isolated REM sleep behaviour disorder. Brain. 144 (4), 1118-1126 (2021).
  18. Ucciferri, C. C., et al. Scoring central nervous system inflammation, demyelination, and axon injury in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (204), e65738 (2024).
  19. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 136 (Pt 4), 1128-1138 (2013).
  20. Sawamura, M., et al. Single-dose intranasal administration of α-syn PFFs induce lewy neurite-like pathology in olfactory bulbs. Parkinsonism Relat Disord. 112, 105440 (2023).
  21. Guo, J. J., et al. Intranasal administration of α-synuclein preformed fibrils triggers microglial iron deposition in the substantia nigra of Macaca fascicularis. Cell Death Dis. 12 (1), 81 (2021).
  22. Macdonald, J. A., et al. Assembly of α-synuclein and neurodegeneration in the central nervous system of heterozygous M83 mice following the peripheral administration of α-synuclein seeds. Acta Neuropathol Commun. 9 (1), 189 (2021).
  23. Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiol Dis. 105, 84-98 (2017).
  24. Tarutani, A., et al. The effect of fragmented pathogenic α-Synuclein seeds on prion-like propagation. J Biol Chem. 291 (36), 18675-18688 (2016).
  25. Taguchi, T., Ikuno, M., Yamakado, H., Takahashi, R. Animal model for prodromal Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 1961 (2020).
  26. Bousset, L., Brundin, P., Böckmann, A., Meier, B., Melki, R. An efficient procedure for removal and inactivation of alpha-Synuclein assemblies from laboratory materials. J Parkinsons Dis. 6 (1), 143-151 (2016).
  27. Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Sci Rep. 8, 10788 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены