Оптимизация сбора слезы у мышей для анализа мРНК и белка

Резюме

Идентификация биомаркеров РНК и белков из разрывов на мышиных моделях имеет большие перспективы для ранней диагностики различных заболеваний. В данной рукописи представлен комплексный протокол для оптимизации эффективности и результативности выделения мРНК и белков из слез мышей.

Аннотация

Слезная пленка представляет собой высокодинамичную биожидкость, способную отражать связанные с патологией молекулярные изменения не только на поверхности глаза, но и в других тканях и органах. Молекулярный анализ этой биожидкости предлагает неинвазивный способ диагностики или мониторинга заболеваний, оценки эффективности медицинского лечения и выявления возможных биомаркеров. Из-за ограниченного объема образца сбор отрывных образцов требует определенных навыков и соответствующих инструментов для обеспечения высокого качества и максимальной эффективности. В исследованиях на людях были описаны различные методологии отбора проб слез. В этой статье представлено всестороннее описание оптимизированного протокола, специально предназначенного для извлечения информации о белках, связанных со слезами, из экспериментальных моделей животных, особенно мышей. Этот метод включает в себя фармакологическую стимуляцию выработки слезы у 2-месячных мышей с последующим сбором образцов с помощью полосок Ширмера и оценкой эффективности и результативности протокола с помощью стандартных процедур, SDS-PAGE, количественной ПЦР и цифровой ПЦР (дПЦР). Этот протокол может быть легко адаптирован для исследования сигнатуры белка слезы в различных экспериментальных парадигмах. Путем создания доступного, стандартизированного и оптимизированного протокола отбора проб слез для животных моделей цель состояла в том, чтобы преодолеть разрыв между исследованиями на людях и животных, способствуя трансляционным исследованиям и ускоряя прогресс в области исследований глазных и системных заболеваний.

Введение

Слезы считаются ультрафильтратом плазмы, а также описываются как промежуточная жидкость между сывороткой плазмы и спинномозговой жидкостью из-за значительного перекрытия биомолекул, которые они разделяют¹. Сообщалось, что слезы человека содержат белки, слезные липиды, метаболиты и^{электролиты2}. В последнее время также были идентифицированы другие биомолекулы, такие как мРНК, микроРНК и внеклеточные везикулы 3,4,5,6,7.

У человека базальные слезы расположены в слезной пленке, которая состоит из трех слоев: внешнего липидного слоя, который поддерживает поверхность слезы гладкой, чтобы мы могли видеть сквозь нее и предотвращать испарение слезы; средний водный слой, который поддерживает увлажнение глаза, отталкивает бактерии, защищает роговицу и составляет 90% слезной пленки; и, наконец, слой муцина, семейство высокомолекулярных белков, которые контактируют с роговицей и позволяют слезе прилипать^{к глазу}. Распределение слезы по поверхности глаза начинается с выделения из слезной железы. Затем эта жидкость направляется через слезные протоки, чтобы пройти по поверхности глаза и попасть в дренажные каналы. Каждое моргание позволяет слезам равномерно распределиться по всему глазу, сохраняя его влажным⁹.

Слезная пленка представляет собой высокодинамичную биожидкость, способную отражать молекулярные изменения, происходящие не только на поверхности глаза, но и в других тканях и органах. Анализ дифференциальной экспрессии в этой биожидкости представляет собой многообещающий подход к открытию биомаркеров при заболеваниях человека^10,11. Использование слезной пленки в качестве источника биомаркеров для ранней диагностики при различных патологиях в значительной степени облегчается наличием неинвазивных методов сбора. Наиболее распространенным методом сбора слез в медицинских и ветеринарных клиниках является мембранная поддержка (полоска Ширмера), которая действует по принципу капиллярного действия, позволяя воде в слезах перемещаться по длине бумажной тест-полоски или капиллярных трубок, помещенных в нижний конъюнктивальный мешок субъекта 12,13,14. Несмотря на присущие этому методу ограничения получения небольшого объема образца, биохимический анализ состава слезы с использованием различных чувствительных методов облегчил идентификацию потенциальных молекул-биомаркеров^11,15. Протоколы оптимизации и оценки элюирования слезных белков из полосок и капилляров Ширмера у пациентов хорошо задокументированы^16,17. Тем не менее, полные описания оптимизированных протоколов, специально разработанных для извлечения молекулярной информации, связанной со слезами, из экспериментальных животных моделей, доступны, но редки. Существующие методы, такие как индукция слезы путем прямой стимуляции слезной железы¹⁸, хотя и позволяют собирать большие объемы, являются инвазивными и могут вызывать дискомфорт у животных. Неинвазивные методы, такие как сбор слез с поверхности глаза, были описаны как способ выделения ДНК и микроРНК^19,21.

Этот протокол направлен на создание экономически эффективного и оптимизированного метода сбора и обработки слез у мышей. Метод отдает приоритет неинвазивности при получении достаточных объемов слез, пригодных для молекулярного анализа, с помощью таких методов, как SDS-PAGE, qPCR и dPCR. Информация о содержании экстрагированного белка и мРНК может быть затем использована для идентификации потенциальных биомаркеров в существующих экспериментальных моделях заболеваний.

протокол

Все описанные здесь процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Лабораторные животные лечились и обрабатывались в строгом соответствии с рекомендациями журнала по использованию животных и в соответствии с Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмических исследованиях и исследованиях зрения. Здоровье глаз до и после процедур оценивалось путем оценки глазных выделений, опухших век, глазных аномалий и изменений в поведении.

1. Животные и подготовка реагентов

1. Для процедуры используйте трех 2-месячных мышей C57BL/6 самцов на одну репликацию со стартовым весом ~25 г (Рисунок 1). Обрабатывайте каждую мышь по отдельности и положите ее на грелку, чтобы сохранить тепло.
2. Чтобы вызвать выделение слезы, приготовьте исходный раствор пилокарпина в концентрации 20 мг/мл с использованием стерильной воды.
3. Разрежьте тест-полоски Ширмера до 5 мм в длину и согните каждую полоску в выемке под углом 90°.
4. Приготовьте 250 мкл стерильной воды с ингибитором протеазы (1 таблетка на 50 мл, согласно инструкции производителя).

2. Стимуляция и сбор слез

1. Взвесьте каждую мышь индивидуально, чтобы рассчитать подходящую дозировку обработок.
2. Чтобы стимулировать выработку слезы, введите 30 мг/кг пилокарпина внутрибрюшинно с помощью инсулинового шприца 6 мм (рис. 1B). Подождите 2 минуты после введения препарата, чтобы его эффект проявился.
   Примечание: Данные от нестимулированных животных не могли быть получены из-за ограниченной доступности слезной жидкости.
3. Соберите слезы, поместив конец каждого фрагмента полоски Ширмера над центром нижнего века с помощью пинцета, и удерживайте его на месте, пока разрыв не достигнет предела полоски (рисунок 1C). Затем замените полоску. Последовательно поместите по 2 полоски Ширмера в каждый глаз с интервалом в 2 минуты между полосками для сбора. Для процесса сбора разрыва требуется около четырех фрагментов полоски в течение 10 минут на одну мышь.
4. Поместите фрагменты полоски Ширмера в стерильные пробирки на лед, чтобы избежать разложения компонентов. Как только сбор закончится, приступайте к обработке разрыва.

3. Выделение белка

1. Поместите фрагменты полоски в микроцентрифужную пробирку объемом 600 мкл, содержащую 20 мкл стерильной воды с ингибитором протеазы, и центрифугируйте в течение 1 ч при 600 x g при 4 °C, как показано ранее¹⁷ (рис. 1D).
2. Сделайте прокол с помощью инъекторной иглы из нержавеющей стали диаметром 7,5 см на кончике пробирки объемом 600 мкл, содержащей образец (рис. 1E). Затем перенесите эту проколотую пробирку в новую стерилизованную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте образцы при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C, как сообщалось ранее¹⁷, чтобы восстановить объем разбавленных слез. Объем слезной пленки (надосадочная жидкость) будет находиться на дне пробирки.
3. Создайте белковый пул, объединив надосадочную жидкость, извлеченную из всех образцов. В этом эксперименте был получен общий объем около 200 μл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выработка слез может длиться более 1 часа. За это время еще можно собрать слезы.
4. Количественно измерьте общее содержание белка в слезном бассейне с использованием стандартного метода Брэдфорда²².

4. Анализ SDS-PAGE

1. Нагрейте образцы белка при температуре 99 °C в течение 4 минут, чтобы денатурировать белки. Кратковременно смешайте образцы с помощью вихря, чтобы смешать компоненты.
2. Загрузите 30 г количественно определенного содержания белка из каждого образца в 10% гель SDS-PAGE (Таблица 1) и запустите образцы при напряжении 90 В в течение 2 ч, используя стандартный метод²³.
3. После электрофореза покрыть гель раствором для окрашивания (Таблица 1) и инкубировать в течение 30 минут для окрашивания белков.
4. Смойте гель раствором для снятия краски несколько раз, пока фон не станет ясным и не будут видны белковые полосы.
5. Получение изображений с помощью системы документирования геля.

5. Выделение мРНК для количественной ПЦР и цифровой ПЦР

1. Поместите полоски в микроцентрифужную пробирку объемом 600 мкл, содержащую 20 мкл стерильной воды. Сделайте прокол на кончике пробирки, содержащей образец, поместите его в новую стерилизованную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте, как сообщалось ранее в статье «Слезы человека»³, в течение 20 минут при температуре 2000 x g при 4 °C (рисунок 1E-H).
2. Создайте пул из всех образцов. Восстановленный объем этого эксперимента составил примерно 22 мкл надосадочной жидкости на каждую мышь, т.е. 66 мкл общего объема. Поместите пробирки на сухой лед, чтобы избежать деградации биомолекул.
3. Добавьте 200 мкл монофазного раствора фенола и изотиоцианата гуанидиния (коммерчески полученного) и гомогенизируйте пипетированием. Дать постоять 5 минут при комнатной температуре. На этом этапе образцы могут храниться при температуре -20 °C в течение нескольких недель или при -70 °C в течение нескольких месяцев.
4. Добавьте 40 μл хлороформа и перемешайте в вихре в течение 15 с. Дать постоять 2 минуты при комнатной температуре. Центрифуга при 10 000 x g в течение 15 мин при 4°C.
5. Осторожно перенесите водную фазу (не беря интерфазу) в новую пробирку объемом 1,5 мл.
6. Добавьте 0,5 мкл гликогена (0,05 мкг/мкл) к 100 мкл изопропанола и перемешайте с помощью пипетирования. Гликоген осаждается совместно с РНК и не препятствует последующим этапам.
7. Дать постоять 10 минут при температуре -20 °C. Центрифуга при давлении 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Быстро сцедите надосадочную жидкость.
8. Добавьте 200 μл холодного 75% этанола и ресуспендируйте РНК-гранулу путем вортексирования. Центрифугируйте при 8 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
9. Сцедите этанол. Не переворачивая трубку, дайте ей высохнуть на воздухе в течение 20-30 минут. Добавьте 20 μл воды, не содержащей РНКазы, и восстановите.
10. Продолжайте считывать оптическую плотность в микрообъемном спектрофотометре на длинах волн 260 нм и 280 нм для оценки чистоты РНК. Образцы должны находиться на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рибосомные полосы 28S и 18S не могут наблюдаться с использованием агарозного геля из-за особенностей образца. Присутствие других РНК, таких как микроРНК или мРНК, может быть проанализировано с помощью биоанализатора, как показано ранее¹⁸.
11. Синтезируйте кДНК из РНК слез с помощью коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя.
    1. Начните с входной РНК в диапазоне от 10 нг до 5000 нг; В зависимости от используемого набора смешайте его с 1 μL Oligo (dT) и до 12 μL воды, не содержащей РНКазы. Вращайте его при температуре 500 x g в течение 30 секунд и инкубируйте при температуре 65 °C в течение 5 минут.
    2. Добавьте в смесительную пробирку 4 мкл 5x реакционного буфера, 1 мкл ингибитора РНКазы, 2 мкл смеси dNTP и 1 мкл обратной транскриптазы.
    3. Вращайте трубку при давлении 500 x g в течение 30 с, чтобы вытянуть смесь вниз. Затем инкубируйте пробирку при температуре 42 °C в течение 60 минут. Завершите реакцию, инкубируя пробирку при 70 °C в течение 10 минут.
12. Из-за низкой концентрации мРНК в слезах рекомендуется использовать неразбавленную кДНК для кПЦР²⁴. Для этого эксперимента было использовано 150 нг кДНК. Проведите кПЦР с использованием праймеров DNMT3a :
    Вперед: GCCGAATTGTGTGTCTTGGTGGATGACA, обратно: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA и грунтовки GAPDH :
    Вперед: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTCTTA, задний ход: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC в соответствии с инструкциями производителей и процедурами работы оборудования.
    1. Для цикла количественной ПЦР используйте следующую программу: Начальная денатурация: 95 °C в течение 10 мин, затем 45 циклов C 95°C - 15 с, 60 °C - 30 с и 72 °C - 30 с, заканчиваются окончательным продлением при 72 °C в течение 5 мин.
    2. Выполните анализ кривой расплава, чтобы оценить наличие димеров праймера или неспецифических ампликонов в реакции. Температурное нарастание начиналось от 50 °C до конечных 99 °C, с начальным удержанием 90 с для первого шага и удержанием 5 с между каждым шагом.
    3. Для дПЦР²⁵ выполните серийные разведения, чтобы оптимизировать количество кДНК, необходимое для обнаружения интересующей мРНК. В этом эксперименте используются следующие разведения кДНК в воде, не содержащей нуклеаз: 150 нг, 75 нг, 37,5 нг и 18,75 нг кДНК. Использовались ранее упомянутые грунтовки для DNMT3a . Для цикла дПЦР используйте следующую программу: начальная денатурация: 95 °C в течение 2 мин, затем 40 циклов 95 °C - 15 с и 60 °C - 30 с.

Результаты

Протокол, описанный в данной статье, представляет собой простой и доступный метод получения молекулярной информации из слезной жидкости с использованием методов, обычно доступных в большинстве лабораторий молекулярной биологии. Кроме того, протокол может быть масштабирован за счет и...

Обсуждение

Слезная жидкость легко доступна, и определение биомаркеров в слезах может быть использовано в качестве успешного дополнительного метода для ранней диагностики различных заболеваний человека^. В то время как биохимический анализ состава слезы на экспериментальных животн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	1985023
2x Laemmli buffer	Bio-Rad	16-0737
Acetic Acid	Quimica Meyer	64-19-7
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Bradford Reagent	Sigma-Aldrich	B6916
Chloroform	Sigma-Aldrich	1003045143
Coomassie Blue R 250	US Biological	6104-59-2
Ethanol	Quimica Rique	64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder	Thermofisher scientific	SM1331
Glycerol	US Biological	G8145
Glycine	SANTA CRUZ	SC- 29096
Glycogen	Roche	10901393001
HCl	Quimica Rique	7647-01-0
Isopropyl alcohol	Quimica Rique	67-63-0
Methanol	Quimica Meyer	67-56-1
Micro tubes 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micro tubes 600 µl	Axygen	MCT-060-C
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PCR tubes & strips	Novasbio	PCR 0104
Pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503-10g
Protease inhibitor	Roche	11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)	Qiagen	250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)	Qiagen	250001
Real qPlus 2x Master Mix Green	Ampliqon	A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit	Thermofisher scientific	K1622
Schirmer's test strips	Laboratorio Santgar	SANT1553
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
TEMED	Sigma aldrich	102560430
TRI reagent	Sigma-Aldrich	T9424-200ML	monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris	US Biological	T8650
Tris base	Chem Cruz	sc-3715A