Молекулярная визуализация органоидов мозга человека с помощью масс-спектрометрии

Резюме

Был разработан усовершенствованный метод масс-спектрометрической визуализации (MSI) органоидов головного мозга, который позволяет картировать распределения метаболитов в этих моделях. Эта технология дает представление о метаболических путях мозга и сигнатурах метаболитов на ранних этапах развития и при заболеваниях, обещая более глубокое понимание функции мозга человека.

Аннотация

Модели органоидов мозга служат мощным инструментом для изучения развития и функционирования мозга человека. Масс-спектрометрия (MSI), передовая технология, позволяет нам отображать пространственное распределение различных молекул, таких как липиды, сахара, аминокислоты, лекарства и их метаболиты в этих органоидах, и все это без необходимости использования специальных молекулярных зондов. Высокое качество данных MSI зависит от тщательной подготовки образцов. Фиксаторы играют ключевую роль, но обычные варианты, такие как глутаральдегид, параформальдегид и криоконсерванты, такие как сахароза, могут непреднамеренно повлиять на метаболиты тканей. Оптимальная фиксация влечет за собой мгновенную заморозку в жидком азоте. Однако для небольших органоидов более подходящим подходом является переход органоидов непосредственно из инкубатора в подогретый раствор для заделки с последующим замораживанием в этаноле, охлажденном сухим льдом. Еще одним важным этапом является встраивание перед криосекцией, для которой также требуются материалы, совместимые с MSI, поскольку традиционные варианты могут мешать матричному осаждению и ионизации. Здесь представлен оптимизированный протокол для органоидов мозга человека с высоким разрешением-MALDI-MSI, охватывающий подготовку образцов, срезы и визуализацию с использованием масс-спектрометрии. Этот метод демонстрирует молекулярное распределение малых метаболитов, таких как аминокислоты, с высокой точностью и чувствительностью по массе. Таким образом, в сочетании с дополнительными исследованиями органоидов мозга, он может помочь в освещении сложных процессов, управляющих ранним развитием мозга, метаболическими траекториями судьбы клеток и отличительными сигнатурами метаболитов. Кроме того, она дает представление о точном расположении молекул внутри органоида, обогащая наше понимание пространственной организации 3D-моделей органоидов мозга. По мере развития этой области ожидается растущее число исследований, использующих MSI для изучения органоидов мозга и сложных биологических систем, тем самым углубляя понимание метаболических аспектов функционирования и развития мозга человека.

Введение

Модели органоидов, полученные из первичных тканевых стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)^1,2,3, продвинули вперед исследования в области биологии человека, предложив трехмерные модели, которые точно имитируют функции, специфичные для органов, помогая в изучении развития человека, механизмов заболеваний и разработки лекарств ^4,5. В этом контексте разгадка сложностей органоидов мозга имеет решающее значение для понимания как физиологического, так и патологического развития мозга ^6,7, что требует таких технологий, как масс-спектрометрическая визуализация (MSI)^8,9. MSI, в отличие от традиционной масс-спектрометрии, позволяет напрямую картировать без меток сотни и тысячи биомолекул в пределах одного участка ткани, обеспечивая подробное представление о пространственном распределении молекул, таких как липиды, пептиды, аминокислоты, лекарства и их метаболиты, без необходимости использования специальных молекулярных зондов^10,11. Кроме того, молекулярные изображения MSI могут быть совместно зарегистрированы на гистологическом и иммуноокрашенном срезах, что дает полное представление о морфологии тканей, клеточной специфичности и молекулярном составе.

MSI имеет значительные перспективы для исследований органоидов, предлагая понимание молекулярной основы заболеваний, генетических и фенотипических отношений и реакции на стимулы окружающей среды 12,13,14,15. В фармацевтической промышленности MSI облегчает анализ абсорбции, распределения, метаболизма и элиминации лекарственных средств в доклинических моделях^11,16. Кроме того, он помогает в разложении их биотрансформированных метаболитов, которые могут быть фармакологически активными¹⁷.

Среди методов MSI преобладают матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI), десорбционная электрораспыление ионизации (DESI) и масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS) 9,18,19,20,21. Из них MALDI-MSI выделяется своей универсальностью, широким диапазоном масс, возможностями прямого анализа и совместимостью с различными тканеспецифическими химическими соединениями²². Однако, несмотря на свой потенциал, применение MALDI-MSI в исследованиях органоидов мозга остается недостаточно изученным. Чтобы восполнить этот пробел, был введен специализированный протокол анализа органоидов головного мозга с высоким разрешением MALDI-MSI (HR-MALDI-MSI) для оптимизации сохранности тканей, выбора матрицы и условий визуализации, обеспечивая надежное получение высококачественных данных^. Этот подробный протокол демонстрирует возможности HR-MALDI-MSI, чтобы предоставить исследователям дополнительный арсенал для использования мощи этой технологии для изучения метаболического ландшафта органоидов с беспрецедентной детализацией.

протокол

Общее переполнение протокола показано на рисунке 1. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка среза органоидов головного мозга

1. Получить органоиды мозга (размером 2-3 мм при достижении ими 30-60 дней в культуре) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в соответствии с ранее опубликованными отчетами^23,24 и собрать их в нужное время с помощью широких наконечников.
   1. Готовые органоиды трижды промыть 1x фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS) без CaCl₂ и MgCl₂ при комнатной температуре, чтобы промыть среду, а затем очень быстро дистиллированной водой комнатной температуры, чтобы смыть любые соли из DPBS.
2. Приготовьте 10% раствор желатина из холодной рыбьей кожи путем перемешивания и нагревания желатина (10 мг на 100 мл DPBS) при 70-80 °С в течение 2 ч, затем переместите раствор в инкубатор при температуре 37 °С на 30 мин для удаления пузырьков и уравновешивания до температуры инкубатора, где выращивались органоиды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента рекомендуется готовить желатин в свежем виде, но при необходимости его можно использовать до 1 недели (хранить при температуре 4 °C). Желатин затвердевает при комнатной температуре, и его необходимо нагреть перед использованием в качестве раствора для встраивания, чтобы он стал жидким.
3. Прикрепите органоид в центре пластиковой формы (25 мм x 20 мм x 5 мм) с помощью маленького наконечника пипетки и аккуратно влейте в форму 10% раствор для заделки желатина до полного погружения органоида (форма должна быть заполнена примерно наполовину).
   1. Поместите форму в чашку Петри на сухой лед, содержащий холодный 100% этанол, чтобы быстро заморозить его (1-2 минуты). После полного замораживания, о чем свидетельствует изменение цвета на сплошной белый, достаньте органоидно-желатиновый блок из чашки Петри, заверните его в алюминиевую фольгу или поместите в жестяную чашку, запечатанную для предотвращения концентрации воды, и храните при температуре −80°C до готовности к криосекции.
4. Для криосекции поместите пластиковые блоки, содержащие органоиды, в криокамеру при температуре от -20 °C до -25 °C на 10-15 минут, чтобы они уравновесились с температурой камеры. Разделите органоиды на секции 14 мкм с помощью криотома и разморозьте на предметных стеклах с покрытием из оксида индия и олова (слайды ITO) для MSI.
5. Либо сразу отсканируйте структурно однородные срезы в масс-спектрометре, либо запечатайте их в контейнере и храните при температуре -80°C для последующих исследований.

2. Подготовка матрицы и нанесение на нее MALDI-MSI

1. Для MALDI-MSI распылите предметные стекла и покройте участки тканей матрицей, органическим соединением, которое помогает ионизировать различные метаболиты²⁵. Разные матрицы используются для визуализации разных видов молекул; Поэтому, во-первых, необходимо выбрать наиболее подходящую матрицу для исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование было сосредоточено на локализации и распределении малых метаболитов и аминокислот, связанных с митохондриальными метаболическими путями, и матрица была выбрана соответственно (для картирования липидов см. Cappuccio et al.)¹⁵.
2. Во-первых, после снятия предметных стекол ITO с температуры -80 °C, немедленно поместите предметное стекло в эксикатор на 20 минут, чтобы свести к минимуму конденсацию атмосферной воды на поверхностях.
3. Приготовьте N-(1-нафтил) этилендиамина дигидрохлорид (NEDC), который является подходящей матрицей для малых метаболитов, поскольку он дает сильный сигнал исследуемого аналита, не создавая помех фоновым сигналам при m/z 500 Да²⁶. Распылите 10 мг/мл раствора NEDC в 70% метаноле на участки органоидов после высыхания стекла с помощью пневматического распылителя с подогревом.
4. Установите следующие параметры матричного распылителя: температура форсунки = 75 °C, скорость форсунки = 1 250 мм/мин, производительность насоса = 100 μл/мин, количество проходов = 8, расстояние между дорожками = 2,5 мм, расход газа 3 л/мин, время сушки = 10 с и давление газообразного азота 10 фунтов на квадратный дюйм.

3. Контрольно-измерительные приборы MALDI-MSI

1. Чтобы создать платформу MALDI-MSI с высоким разрешением для визуализации метаболитов органоидов мозга, установите источник ионов MALDI с интерфейсом двухионной воронки к масс-спектрометру.
2. Используйте подключенный лазер Nd с модуляцией добротности, утроенной частотой и длиной волны 349 нм, частотой следования 1 кГц и энергией импульса примерно 1,3-1,4 μДж.
3. Чтобы избежать чрезмерной дискретизации, сфокусируйте лазер на пятно размером ~15 мкм в диаметре.
4. Прикрепите образец к инжекторному столику MALDI. Эксплуатация и поддержание ионной воронки высокого давления на уровне 7,4–7,5 мм рт. ст. и поддержание ионной воронки низкого давления на уровне 1,6–1,8 мм рт. ст.
5. Подайте радиочастотные напряжения 604 кГц, 80 В0 пик и 780 кГц, 191 В0 пик на воронки ионов высокого и низкого давления соответственно.
6. Для повышения чувствительности к малым метаболитам в низком диапазоне масс уменьшите амплитуды радиочастот в воронке низкого и высокого давления источника MALDI-MSI примерно до 20% и 15% соответственно.
7. Установите массовое разрешение на 70 000. Выберите площадь и размер пикселя (25 мкм/пиксель) для измерения в программном обеспечении инжектора MALDI.

4. Сбор и анализ данных MALDI-MSI

1. Сбор данных в диапазоне м/з 80-900 как в отрицательном, так и в положительном ионном режимах. Отсканируйте образцы с боковым разрешением 25 мкм на пиксель для органоидных сечений размером 14 мкм.
2. Установите время инжекции ионов на масс-спектрометре равным 250 мс и получите масс-спектры с преобразованием Фурье (FTMS) в режиме профиля при выключенной автоматической регулировке усиления (AGC)²⁶.
3. Используйте пики матрицы NEDC в качестве внутренней онлайн-калибровки массы, что приводит к точности массы лучше ±5 ppm.
4. Используйте совместимое программное обеспечение для обработки данных. Импортируйте спектральные данные MSI непосредственно в программное обеспечение, затем выполните коррекцию базового уровня с помощью алгоритма свертки и нормализуйте данные с помощью общего количества ионов (TIC).
5. Сгенерируйте список характеристик ионных изображений из файлов исходных данных, используя ширину ячейки Δm/z = 0,01 или ±5 ppm, чтобы различать m/z изображения на основе массового дефекта и покрытия пикселей.
6. Создавайте изображения в ложных цветах (Jet) или RGB (красно-зеленый и синий) из отдельных видов ионов метаболитов. Загрузите m/z список файлов исходных данных, полученных из MALDI-MSI, в базу данных метаболомов человека (HMDB) (допуск по массе <5 ppm относительно теоретического m/z) для идентификации метаболитов.
   Примечание: Точная масса, прогнозируемая формула и структура метаболита, полученные из данных ЖХ-МС/МС, также используются для запроса к базам данных метаболомики (например, HMDB, Metlin) для сравнения и идентификации метаболитов.

Результаты

Вот протокол, который оптимизирует молекулярную (метаболическую) визуализацию с помощью MSI (Рисунок 1, см. также Cappuccio et al.)¹⁵. Наиболее достоверные данные и сохранение морфологии тканей достигнуты при использовании 10% желатина из холодной кожи рыб, что подтверждено гистологическим окрашиванием серийных срезов. С помощью рыбьего желатина, встраиваемого в 60-дневные органоиды человеческого мозга, метаболиты, связанные с циклом Кребса, были картированы с помощью MSI, демонстрируя их пространственное распределение (рис. 2).

В целом, оптимизированный протокол неизменно обеспечивал надежные результаты: 10% желатина из холодной кожи рыбы в качестве предпочтительного материала для встраивания и настройки распыления матрицы NEDC были точно настроены для повышения разрешения изображения. Обнаруженные небольшие метаболиты в органоидах мозга дают ценную информацию о молекулярной сложности этой ткани.

Рисунок 1: Общий конвейер исследования метаболома органоидов головного мозга человека. Органоиды, полученные из фибробластов индивидуума с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, используются для LC-MS и MSI, чтобы подчеркнуть пространственное распределение метаболитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Картирование метаболитов, связанных с циклом Кребса. Идентификация и распределение метаболитов, связанных с циклом Кребса, с использованием 60-дневных органоидов, полученных от здоровых людей из контрольной группы с использованием MSI. Показано окрашивание гематоксилином и эозином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Усовершенствованный протокол для MALDI-MSI органоидов человеческого мозга с высоким разрешением тщательно учитывает ключевые шаги для обеспечения надежности результатов. Первостепенное значение приобретает сохранение образцов, и чтобы избежать растрескивания и повреждения тканей, предлагается альтернативный метод замораживания, включающий подогретый раствор для заделки и этанол, охлаждаемый сухим льдом. Этот протокол лучше всего подходит для тканей мельчайшего размера, таких как органоиды человеческого мозга¹⁵. Материалы для встраивания, такие как компаунд для оптимальной температуры резки (OCT) и встраивание парафина с фиксацией формалина (FFPE), предостерегаются из-за их влияния на осаждение матрицы и ионизацию. Вместо этого 10% желатин из холодной кожи рыбы выделен как оптимальное решение для встраивания, демонстрируя его эффективность в сохранении целостности тканей во время криосечения¹⁵. Кроме того, выбор матрицы и методов ее осаждения, таких как сухое распыление, является обязательным условием для минимизации делокализации малых метаболитов с низким содержанием m/z и повышения разрешения изображения.

Прочность и надежность протокола обусловлены успешным обнаружением и визуализацией широкого спектра молекул в органоидах мозга^{человека15}, что дает бесценную информацию об их пространственном распределении и потенциальном биологическом значении. Эти результаты значительно расширяют понимание сложного молекулярного ландшафта внутри органоидов мозга, выясняя ключевые сигнальные пути и метаболические процессы, лежащие в основе развития и функционирования мозга.

В то время как текущие данные дают новое представление о локализации различных видов, источник визуализации Spectroglyph MALDI, используемый в этом исследовании, еще не достиг разрешения на уровне одной клетки (в настоящее время ~10-20 мкм). Другие платформы, такие как timsTOF от Bruker и MRT от Water, могут обеспечить разрешение одиночных клеток на длине волны 5 мкм, поэтому важно помнить об инструменте, который будет использоваться для экспериментов.

Несмотря на эти ограничения, HR-MALDI-MSI высокого разрешения органоидов головного мозга имеет значительные перспективы. Возможность картирования распределений метаболитов и липидов внутри органоидов предлагает уникальную точку зрения на траектории метаболической судьбы клеток, пути и отличительные сигнатуры, имеющие решающее значение для развития и созревания органоидов. Эта методология служит связующим звеном между традиционной гистологией и молекулярным анализом, способствуя более глубокому пониманию взаимосвязей между геномом, феномом и реакциями окружающей среды.

Таким образом, оптимизированный протокол для HR-MALDI-MSI органоидов человеческого мозга представляет собой ценный актив для исследователей, изучающих органоидные модели. Этот метод закладывает основу для дальнейшего прояснения молекулярных тонкостей, лежащих в основе развития и функционирования мозга, путем тщательного рассмотрения критических шагов, устранения неполадок и признания ограничений. По мере того, как технологии MSI развиваются и становятся все более доступными, они готовы углубить наше понимание раннего развития человека, моделирования заболеваний и разработки лекарств.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S, 2S)-1,2-di-1-Naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	1052707-27-3	Matrix substance for MALDI-MS, ≥99.0% (HPLC)
1× Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies, USA	14190-144	Without CaCl2 and MgCl2
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	2069G	Reduce potential contamination
Cryomolds	Tissue-Tek	25608-916	Standard mold with flat-surface
Entellan	Fisher Scientific	M1079610500	Cover slips
Eosin Y	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	E511-25	Certified Biological Stain
Fish gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G7041	Powder form from cold water fish skin
Hematoxylin	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	517-28-2	Certified biological stain Elevated pressure imaging source with
HTX M5+ sprayer	HTX Technologies LLC, Carrboro, USA		Matrix sprayer
Indium tin	Hudson Surface Technology,	PL-IF-000010-P25	Provide a conductive surface for MALDI imaging
MALDI ion source	Spectroglyph LLC, USA		dual ion funnel interface
Methanol	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	67-56-1	HPLC grade
oxide (ITO) conductive–coated slides	New York, United States
Porcine gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G1890	Powder form from porcine skin
Q-Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA		High resolution mass spectrometry
SCiLS Lab software	version 2024a Pro		for processing the data
Water	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	W6500	HPLC grade
	(Waltham, MA, USA)