Эффективное обнаружение популяционных клеток боковой стороны Хёхста с помощью проточной цитометрии

Резюме

В данной работе мы показываем, что мощные лазеры с длиной волны 375 нм и 405 нм могут эффективно возбуждать Hoechst 33342 и служить жизнеспособной альтернативой лазеру с длиной волны 355 нм для обнаружения клеток боковой популяции (SP), тем самым расширяя диапазон доступных лазеров в приложениях проточной цитометрии.

Аннотация

Клетки боковой популяции (SP) идентифицируют с помощью окрашивания по методу Hoechst 33342 и анализируют с помощью проточной цитометрии (FCM). Метод Hoechst SP используется для выделения стволовых клеток на основе свойств оттока красителя транспортеров АТФ-связывающей кассеты (ABC). Первоначально этот метод использовался для идентификации и выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), но в настоящее время он эволюционировал и в первую очередь сосредоточился на идентификации и выделении раковых стволовых клеток (ОСК). Традиционный метод обнаружения FCM использует лазер с длиной волны 355 нм для возбуждения красителя для обнаружения SP-клеток. В ходе этого исследования мы успешно определили альтернативные подходы к возбуждению красителем, которые могут эффективно заменить обнаружение SP-клеток с помощью лазера с длиной волны 355 нм. Это достигается за счет использования мощных лазеров с длиной волны волны 375 нм или 405 нм. Это позволяет нам проявлять повышенную селективность при обнаружении SP-клеток, а не ограничиваться только лазерной проточной цитометрией с длиной волны 355 нм.

Введение

Клетки боковой популяции (SP) идентифицируют с помощью окрашивания по методу Hoechst 33342 и анализируют с помощью проточной цитометрии (FCM). SP-клетки характеризуются выкачиванием флуоресцентного красителя ДНК из клеток через их транспортер АТФ-связывающей кассеты (ABC) ^1,2. Первоначально метод был разработан для выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК⁾ костного мозга мышей1. SP-клетки костного мозга были обогащены популяцией ГСК, характеризующихся низкой экспрессией CD117⁺Sca-1^{+Lin-Thy1 3,4}. После этого метод широко использовался для выделения и обогащения стволовых клеток из других тканей, включая сердечную мышцу⁵, печень⁶,^{легкие 7}, почку⁸ и передний мозг⁹. В частности, в последнее десятилетие этот метод применялся для выделения раковых стволовых клеток (ОСК). ЦСК представляют собой небольшую популяцию клеток, обладающих свойствами инициации опухоли, самообновления, устойчивости к химиотерапии и метастатическим потенциалом¹⁰. ЦСК были первоначально идентифицированы при злокачественных новообразованиях^{кроветворения 11} и впоследствии наблюдались при различных солидных опухолях, таких как рак предстательной железы¹², яичников¹³, желудка¹⁴, молочной железы¹⁵ и рака легких¹⁶. Несмотря на доступность различных методов идентификации ЦСК, метод SP остается предпочтительным выбором благодаря его широкой применимости к различным тканям и клеточным линиям. Более того, это ценный метод, который выделяет РСК с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS)16,17,18. Результаты эксперимента показывают, что SP-клетки проявляют выраженную онкогенность и демонстрируют повышенные уровни экспрессии генов, ассоциированных со стволовыми клетками^19,20. Наше предыдущее исследование²¹ также продемонстрировало, что транскриптомный анализ изолированных SP-клеток при множественной миеломе выявляет обогащение сигнальных путей, связанных со стволовыми клетками, таких как путь ежа. Между тем, мы провели анализ обогащения путей генов, дифференциально экспрессирующихся в SP-клетках острого миелолейкоза²². Измененные гены были обогащены путями, связанными со стволовыми клетками (Wnt/β-катенин, TGF-β, Hedgehog, Notch). Мы обнаружили, что клетки 1 x 10⁵ SP могут образовывать опухоли у мышей с нулевым числом BALB/c²², в то время как клетки без SP не могут, что указывает на то, что клетки SP обладают характеристиками стволовых клеток лейкемии. Эффективность метода Hoechst SP в идентификации РСК очевидна.

Протокол Hoechst SP был усовершенствован и усовершенствован по мере развития исследований. Протокол предусматривает строгий контроль концентрации красителя, плотности клеток, температуры и продолжительности инкубации, состава буфера и значения pH. Образцы клеток, подготовленные в соответствии с этим протоколом, подвергали проточному цитометрическому анализу. Из-за возбуждения красителя Hoechst ультрафиолетовым лазером на длине волны 355 нм и детектирования его флуоресцентного излучения с помощью фильтра 690/50 нм (Hoechst Red) и фильтра 450/50 нм (Hoechst Blue) для FCM требуется лазер с длиной волны 350 нм. Тем не менее, лазеры с длиной волны 350 нм обычно не используются в большинстве FCM из-за их высокой стоимости. Следовательно, мы попытались найти альтернативный подход к возбуждению красителя для эффективного обнаружения SP-клеток с помощью проточной цитометрии. В этом исследовании была оценена способность лазеров с длиной волны 375 нм и 405 нм обнаруживать SP-элементы и сравниваться с возможностями лазера с длиной волны 355 нм. Наши результаты демонстрируют удивительное сходство между SP-ячейками, обнаруженными лазерами с длиной волны 355 нм, 375 нм и 405 нм. Эти результаты свидетельствуют о том, что мощные лазеры с длиной волны 375 нм и 405 нм могут служить реальной альтернативой лазеру с длиной волны 355 нм для обнаружения SP-клеток. Включение дополнительных возбуждающих источников света для Hoechst 33342 облегчает использование большего количества моделей проточной цитометрии.

протокол

В экспериментах в этом исследовании приняли участие в общей сложности 10 мышей C57BL/6 в возрасте от 8 до 12 недель. Экспериментальные операции проводились в соответствии с протоколом, который был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Сычуаньского университета (#201609309). Экспериментальные материалы и параметры проточной цитометрии, использованные в данной статье, приведены в Таблице материалов.

1. Выделение и забор клеток костного мозга мыши

1. Усыпляйте мышей в строгом соответствии с рекомендациями учреждения. Чтобы вызвать потерю сознания у мышей, вводят ингаляционные анестетики, начиная с 2% изофлурана, с последующим постепенным увеличением дозы до 5% изофлурана до прекращения дыхания.
2. Препарируйте мышей в операционном блоке или вытяжном шкафу. Очистите и простерилизуйте мышей с помощью 70% этанола.
3. Острыми ножницами разрежьте кожу и мышцу ноги полностью и рассеките бедренные кости.
4. Аккуратно раздавите бедренную кость шлифовальным стержнем в ступке и промойте клетки костного мозга средой DMEM, пока кость не станет белой.
5. Полученные клетки костного мозга отфильтровать с помощью фильтра 100 мкм в пробирки объемом 15 мл. Центрифуга при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C.
6. Выбросьте надосадочную жидкость и лизируйте остаточные эритроциты с 1 мл буфера для лизиса эритроцитов в течение 1 мин при 4 °C. Центрифуга при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. После центрифугирования снова промойте средой DMEM.
7. Ресуспендируйте клетки в 2 мл инкубационного раствора (среда DMEM + 5% FBS), подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 1,0 x 10⁶ клеток/мл с помощью инкубационного раствора.

2. Клеточное окрашивание

1. Добавьте 2 мл суспензии клеток костного мозга от каждой мыши с 5 мкг/мл Hoechst 33342. К еще 1 мл аликвоты добавьте 100 мкМ верапамил в качестве отрицательного контроля.
2. Выдерживать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 90 мин с легким перемешиванием каждые 30 мин.
3. После инкубации охладите клетки на льду в течение 5 минут, а затем центрифугируйте при 250 x g в течение 5 минут при 4 °C. Повторно суспендируйте элементы в холодном растворе (HBSS + 2% FBS). Центрифугируйте при температуре 4 °C в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
4. Ресуспендируйте полученную клеточную гранулу в 500 мкл проточного раствора на образец. Перед анализом FCM добавьте в клетки 2 мкг/мл йодида пропидия (PI) и поместите на лед примерно на 5 минут.

3. Проточная цитометрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Краткое описание различных используемых систем и конфигураций см. в Таблице 1.

1. Калибровка значений коэффициента вариации (CV) необходимых каналов с помощью ежедневного контроля качества (QC) флуоросфер в FCM и проведение тестирования образцов после успешного завершения контроля качества.
   1. Выберите ярлык программного обеспечения на рабочем столе и запустите программное обеспечение.
   2. Выберите «Начать контроль качества/Стандартизация» в меню «Контроль качества/Стандартизация», чтобы получить доступ к эксперименту по контролю качества.
   3. Вставьте пробирку для образцов флюоросфер QC в держатель пробирки.
   4. Нажмите кнопку Пуск , чтобы загрузить образец и начать выполнение процедуры контроля качества. FCM готовы к использованию после прохождения контроля качества.
2. Возбуждайте краситель Hoechst 33342 тех же образцов лазером с длиной волны 355 нм, 375 нм и 405 нм соответственно для детектирования красного цвета Hoechst в канале 690/50 нм и синего цвета Hoechst в канале 450/50 нм.
   1. Создайте новый эксперимент, выбрав пункт Новый эксперимент в меню Файл, укажите путь к файлу и сохраните эксперимент.
   2. Выберите «Задать канал » в меню «Настройки». Установите флажок сигнала канала (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660), затем добавьте название реагента в столбец Метка (Y585: PI; V450: Hoechst Blue-405 нм; V660: Hoechst красный - 405 нм; NUV450: Hoechst Blue-375 нм; NUV660: Hoechst Blue-375 нм; UV450: Hoechst Blue-355 нм; UV660: Hoechst Blue-355 нм).
   3. Щелкните значки Псевдоцветные графики в области графика, чтобы создать графики. Выберите имя оси, чтобы изменить отображаемый канал.
   4. Нажмите «Добавить пробирку » на экране «Пробирка», чтобы создать новые образцы пробирок и изменить их имена.
   5. Выберите Выполнить , чтобы загрузить выборку, просмотреть графики и установить стропы. Отрегулируйте настройки усиления и порога. Выберите Запись , чтобы сохранить данные.
3. Разработайте логику настройки гейта.
   1. Для первого графика щелкните по оси X, чтобы выбрать FSC-W, и щелкните по оси Y , чтобы выбрать FSC-A. Выберите Polygon Gate , чтобы нарисовать строп A, чтобы обвести отдельную ячейку и исключить смежные ячейки (рисунок 1A).
   2. Для второго графика щелкните по оси X, чтобы выбрать FSC-A, и щелкните по оси Y, чтобы выбрать SSC-A. Выберите Polygon Gate , чтобы нарисовать элемент B для разделения нефрагментарных клеток и исключения клеточного мусора (рисунок 1B).
   3. Для третьего графика щелкните по оси X, чтобы выбрать PI-A, и щелкните по оси Y, чтобы выбрать SSC-A. Выберите многоугольный вентиль , чтобы нарисовать строб D. Выберите живые ячейки с отрицательным PI (рис. 1C) и нарисуйте стрит C, чтобы получить живые клетки.
   4. Для четвертого двумерного графика щелкните по оси X, чтобы выбрать Hoechst Red, и щелкните по оси Y , чтобы выбрать Hoechst Blue. Щелкните правой кнопкой мыши Plot и выберите Property в раскрывающемся меню. Выберите «Линейный формат» fили обе оси X и Y. Выберите Polygon Gate для рисования гейта SP для получения ячеек SP (рис. 1D).
4. Чтобы оценить пригодность образца, используйте 355 нм специфического проточного цитометра²³ для обнаружения SP-клеток.
5. Используйте лазеры 355 нм (мощность лазера: 20 мВт) и 405 нм (мощность лазера: 80 мВт) одновременно для обнаружения как контрольных клеток (с добавлением верапамила), так и экспериментальных клеток.
6. Регистрируйте флуоресцентные сигналы на каналах 690/50 нм и 450/50 нм, соответствующих двум лазерам. Наблюдайте за эффективной стимуляцией красителя Hoechst 33342 лазерами с длиной волны 355 нм и 405 нм с помощью прозрачных SP-клеток (рис. 2B-C).
7. Для тех же образцов используют лазеры 375 нм (мощность лазера: 60 мВт) и 405 нм (мощность лазера: 80 мВт) для детектирования клеток.

Результаты

На рисунке 2 контрольную группу лечили верапамилом, который блокирует транспортеры ABC в стволовых клетках для предотвращения элиминации Hoechst 33342. Таким образом, стволовые клетки в группе неверапамила вытесняют Hoechst 33342 и образуют отрицательную клеточную популяцию, извес...

Обсуждение

Мы использовали описанный протокол для проведения трех экспериментов, в каждом из которых участвовало 3-4 мыши, в результате чего было получено в общей сложности 10 мышей. Доля SP-элементов колебалась от 0,05% до 0,76%. Важно отметить, что среди мышей наблюдались индивидуальные вариации. Мы исп?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629